Detektion von zerebralen Mikroblutungen im Rattenmodell

Zerebrale Mikroblutungen (CMHs) sind neuroinflammatorische Hirnblutungen, die durch eine Störung der Blut-Hirn-Schranke verursacht werden und zum Austreten von roten Blutkörperchen (RBCs) in das Hirngewebe führen.

Um CMHs zu erkennen, beginnen Sie mit fixiertem Hirngewebe von einer Ratte mit CMHs.

Tauchen Sie das Gewebe zur Kryoprotektion in Saccharose.

Schneiden Sie das Gewebe mit einem Kryomikrotom und sammeln Sie einen Schnitt auf einem Objektträger.

Waschen, um Reste des Fixiermittels zu entfernen.

Tragen Sie Hämatoxylin-Farbstoff auf, der an ein Metallkation gebunden ist, das mit negativ geladener DNA interagiert und den Zellkern rötlich-violett färbt.

Tragen Sie anschließend Säure-Alkohol auf, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen, und tragen Sie dann ein alkalisches Bläuungsmittel auf, um das saure Milieu zu neutralisieren und den Farbstoff in seine blaue Form umzuwandeln, wodurch der Kontrast verbessert wird.

Waschen Sie das Tuch mit Alkohol, um das Eindringen von Flecken zu verbessern, und tragen Sie dann Eosin auf, um die Erythrozyten rot-orange und die Gewebekomponenten rosa zu färben.

Entwässern Sie das Gewebe mit steigenden Alkoholkonzentrationen und reinigen Sie es mit Xylol zur mikroskopischen Visualisierung.

Nehmen Sie Bilder auf, um die rot-orange gefärbten lecken Erythrozyten zu erkennen und CMHs zu bestätigen.

Nachdem Sie das Gehirn isoliert haben, tauchen Sie es mindestens sechs Stunden lang in 20% Saccharose in PBS oder bis das Gehirn auf den Boden der Röhre sinkt. Wechseln Sie die Lösung zu 30% Saccharose und fixieren Sie sie für weitere sechs Stunden.

Bereiten Sie abschließend 10 Millimeter dicke Hirngewebeschnitte mit einem Kryostaten vor. Beginnen Sie mit der H&E-Färbung, indem Sie die Objektträger in destilliertem Wasser waschen. Tauchen Sie dann acht Minuten lang in Hämatoxylinlösung. Nach dem Färben fünf Minuten lang unter fließendem Leitungswasser waschen. 30 Sekunden lang in 1% Säure-Alkohol differenzieren.

Nach dem Waschen in fließendem Leitungswasser für eine Minute 30 Sekunden bis eine Minute in 0,2 % Ammoniakwasser oder gesättigter Lithiumcarbonatlösung färben. Anschließend fünf Minuten lang unter fließendem Leitungswasser waschen. Mit Eosinlösung 30 Sekunden bis eine Minute gegenfärben. Dehydrieren Sie mit 90 % Alkohol, dann 95 % Alkohol und absolutem Alkohol für jeweils 0,5 bis 2 Minuten.

Nach der Dehydrierung 30 Sekunden lang in Xylol klären. Analysieren Sie nach der Montage die H&E-Färbung mit einem Hellfeld-Fluoreszenzmikroskop. Die roten Blutkörperchen, die aus den Blutgefäßen freigesetzt werden und Bestandteile der CMHs sind, erscheinen unter der H&E-Färbung in rot-orange.