JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Neurowissenschaften
0 Aufrufe • 4:53 Min. • July 8th, 2025
Beginnen Sie mit einem Deckglas mit kultivierten Neuronen, die synaptische Vesikelmembranproteine exprimieren, einschließlich fluoreszenzmarkiertem Synaptophysin und Synaptotagmin-1.
Entfernen Sie das Medium, fügen Sie eine Mischung aus Depolarisationspuffer und Primärantikörpern hinzu und inkubieren Sie.
Die Pufferionen dringen in die Zellen ein und stimulieren die Fusion der synaptischen Vesikel mit der Membran, die Synaptotagmin-1 freilegt.
Die primären Antikörper binden selektiv an das exponierte Synaptotagmin-1.
Den Puffer verwerfen und mit dem Medium waschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen.
Frisches Medium einführen und inkubieren, um die Membraninternalisierung zu erleichtern, wobei recycelte Vesikel mit markiertem Synaptophysin und antikörpergebundenem Synaptotagmin-1 gebildet werden.
Entfernen Sie das Medium, fixieren Sie die Zellen und waschen Sie es.
Einführung eines Blockierungspuffers auf Detergenzbasis mit Fluorophor-gekoppelten Sekundärantikörpern.
Das Detergens permeabilisiert die Zellen, so dass die sekundären Antikörper mit dem antikörpergebundenen Synaptotagmin-1 interagieren können.
Heben Sie den Deckglas an, waschen Sie ihn mit Wasser und trocknen Sie i
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