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Beginnen Sie mit einem Deckglas mit kultivierten Neuronen, die synaptische Vesikelmembranproteine exprimieren, einschließlich fluoreszenzmarkiertem Synaptophysin und Synaptotagmin-1.
Entfernen Sie das Medium, fügen Sie eine Mischung aus Depolarisationspuffer und Primärantikörpern hinzu und inkubieren Sie.
Die Pufferionen dringen in die Zellen ein und stimulieren die Fusion der synaptischen Vesikel mit der Membran, die Synaptotagmin-1 freilegt.
Die primären Antikörper binden selektiv an das exponierte Synaptotagmin-1.
Den Puffer verwerfen und mit dem Medium waschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen.
Frisches Medium einführen und inkubieren, um die Membraninternalisierung zu erleichtern, wobei recycelte Vesikel mit markiertem Synaptophysin und antikörpergebundenem Synaptotagmin-1 gebildet werden.
Entfernen Sie das Medium, fixieren Sie die Zellen und waschen Sie es.
Einführung eines Blockierungspuffers auf Detergenzbasis mit Fluorophor-gekoppelten Sekundärantikörpern.
Das Detergens permeabilisiert die Zellen, so dass die sekundären Antikörper mit dem antikörpergebundenen Synaptotagmin-1 interagieren können.
Heben Sie den Deckglas an, waschen Sie ihn mit Wasser und trocknen Sie ihn.
Legen Sie das Deckglas mit der Vorderseite nach unten auf einen Objektträger mit einem Einbettmedium für die optische Analyse der doppelt markierten recycelten Vesikel.
600 Mikroliter 1x Depolarisationspuffer und 10 Milliliter Zellkulturmedium im Wasserbad auf 37 Grad Celsius vorwärmen. Geben Sie 1 Mikroliter Maus-Anti-SYT1-Antikörper in den 1x Depolarisationspuffer und wirbeln Sie ihn 10 Sekunden lang auf. Nachdem Sie das Zellkulturmedium aus den Zellen entfernt und verworfen haben, geben Sie 200 Mikroliter der Depolarisations-Antikörpermischung in jede Vertiefung
.
Inkubieren Sie die Platte 5 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 im Inkubator. Entfernen und entsorgen Sie den Depolarisations-Antikörper-Mix und waschen Sie die Zellen dreimal mit Zellkulturmedium. Geben Sie 1 Milliliter Zellkulturmedium in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie 30 Sekunden lang bei Raumtemperatur.
Entfernen Sie dann 750 Mikroliter Medium und fügen Sie die gleiche Menge frisches Medium hinzu. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal. Als nächstes entfernen und verwerfen Sie das Zellkulturmedium und fügen Sie 300 Mikroliter 4% PFA in 1x PBS hinzu.
Zum Schluss 20 Minuten bei 4 Grad Celsius inkubieren, bevor Sie dreimal für je 5 Minuten mit 1x PBS waschen. Verdünnen Sie den sekundären Fluorophor-gekoppelten Antikörper in 200 Mikrolitern Blockierungspuffer für jede Vertiefung bei einer Verdünnung von 1 bis 1.000. Entfernen und entsorgen Sie das 1x PBS aus jeder Vertiefung, die Deckgläser mit den kultivierten Neuronen enthält.
Geben Sie 200 Mikroliter Blockierungspuffer-Antikörpermischung in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie 60 Minuten lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation dreimal für 5 Minuten mit 1 Milliliter 1x PBS.
Geben Sie anschließend einen 7-Mikroliter-Tropfen Einbettungsmedium auf den Objektträger. Entfernen Sie das Deckglas von der 24-Well-Platte, indem Sie es mit einer Kanüle anheben und mit einer Pinzette greifen. Tauchen Sie das Deckglas in destilliertes Wasser, um das PBS zu entfernen, und trocknen Sie es vorsichtig, indem Sie eine Kante mit einem weichen Tuch berühren.
Drehen Sie das Deckglas auf das Tröpfchen des Einbettmediums, so dass die Oberfläche, die die Zellen trägt, dem Objektträger zugewandt ist, wodurch die Zellen in das Einbettungsmedium eingebettet werden. Lassen Sie die Objektträger ein bis zwei Stunden unter der Haube trocknen und decken Sie sie ab, um Lichteinwirkung zu vermeiden. Lagern Sie die getrockneten Objektträger in einer Objektträgerbox bei 4 Grad Celsius.