Immunfärbung von Neuronen, die mit Alpha-Synuclein-Aggregaten behandelt wurden

Beginnen Sie mit einer adhärenten Neuronenkultur, die mit Alpha-Synuclein oder Alpha-S-Aggregaten behandelt wird, bei denen es sich um Klumpen eines fehlgefalteten Proteins handelt.

Diese Klumpen aggregieren zu intrazellulären Einschlüssen.

Ersetzen Sie das Medium durch eine Fixierlösung, um die zelluläre Integrität zu erhalten.

Entfernen Sie die Fixierlösung und waschen Sie sie mit Puffer.

Fügen Sie als Nächstes ein Tensid hinzu, um die Zellmembran zu permeabilisieren.

Entfernen Sie das Tensid und waschen Sie es mit Puffer.

Führen Sie eine Blockierungslösung ein, um eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern.

Inkubieren Sie nun mit primären Antikörpern, die spezifisch an Alpha-S-Einschlüsse und Strukturproteine binden.

Mit Puffer waschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen.

Inkubieren Sie mit fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpern.

Entfernen Sie ungebundene Antikörper.

Füge einen fluoreszierenden Farbstoff hinzu, um den Zellkern zu markieren.

Entfernen Sie den Fleck und waschen Sie ihn mit Puffer.

Montieren Sie das Deckglas mit Neuronen mit Hilfe von Montagemedien auf einer Folie.

Beobachten Sie unter einem Fluoreszenzmikroskop immunmarkierte Alpha-S-Einschlüsse innerhalb des Neurons.

Um eine Immunfluoreszenz in einem chemischen Abzug durchzuführen, fixieren Sie die Neuronen 15 Minuten lang mit 2 % Paraformaldehyd in PBS und 5 % Saccharoselösung bei Raumtemperatur ohne Schütteln. Entfernen Sie nach 15 Minuten die Fixierlösung und waschen Sie die Neuronen dreimal kurz mit PBS.

Als nächstes permeabilisieren Sie die Neuronen mit 0,3 % nichtionischem Tensid in PBS für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie dann die Neuronen dreimal kurz mit PBS. Inkubieren Sie die Neuronen mit 3% FBS in PBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem orbitalen Shaker, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren. Inkubieren Sie anschließend die Neuronen mit geeigneten primären Antikörpern, die in 3 % FBS in PBS gelöst sind, über Nacht im Kühlraum oder Kühlschrank bei 4 Grad Celsius auf einem Orbitalschüttler.

Am nächsten Tag entfernen Sie die Antikörperlösung und waschen die Zellen dreimal kurz mit PBS. Inkubieren Sie dann die Neuronen mit dem entsprechenden fluoreszierenden Sekundärantikörper, der in 3 % FBS in PBS gelöst ist, für 1 Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln auf einem Orbitalschüttler.

Entfernen Sie die Antikörperlösung und waschen Sie sie dreimal kurz mit PBS. Anschließend färben Sie die Neuronen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln auf einem Orbitalschüttler mit DAPI-Lösung. Entfernen Sie nach 15 Minuten die Antikörperlösung und waschen Sie sie dreimal kurz mit PBS. Befestigen Sie die Deckgläser mit einem lichtbeständigen Eindeckmedium auf der Folie.