Ein In-vitro-Modell der Dehnungsverletzung in humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Neuronen
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowissenschaften
0 Ansichten • 3:33 Min. • July 8th, 2025
Beginnen Sie mit einer bodenlosen Multi-Well-Platte, die an einer Silikonmembran befestigt ist. Die Membran ist mit einem Biopolymer beschichtet, um die Zelladhäsion zu erleichtern.
Führen Sie humane induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Neuronen (hiPSCNs), die in einem Medium suspendiert sind, in die Vertiefungen ein. Das Medium wird mit extrazellulärer Matrix oder EZM-Proteinen ergänzt, um die Zelladhäsion zu verbessern.
Inkubieren Sie die Platte, so dass die Zellen an den EZM-Proteinen und dem Biopolymer haften können, was eine gleichmäßige Interaktion mit der Membranoberfläche fördert.
Befestigen Sie anschließend die Platte auf der Bühne eines Verletzungsgeräts.
Wenden Sie mit dem Gerät eine Vertiefung auf die Membran an, um eine kontrollierte mechanische Belastung der Neuronen zu erzeugen.
Der Stress stört das Zytoskelett, was zur Degeneration von Zellvorsprüngen, den sogenannten Neuriten, und zur Bildung kleiner Schwellungen entlang der Neuriten führt.
Der Stress schädigt auch die Integrität der Zellmembran, was zum Zelltod führt.
Die hiPSCNs, die einen Phänotyp einer Dehnungsverletzung aufweisen, sind nun bereit für die Analyse.
Um die Platte zu dehnen, ändern Sie die Felder "Dateiname" und "Dateipfad" im virtuellen Instrument "Position Tracking" in einen eindeutigen Dateinamen und klicken Sie auf den Pfeil "Run". Stellen Sie die Tiefe und Dauer der Einkerbung in den Feldern "Verletzung" und "Verletzungsdauer" im virtuellen Instrument des Bewegungsbedienfelds ein. Wenn sich die Platte in der Nullposition befindet, führen Sie das virtuelle Instrument "Movement Control Panel" aus und klicken Sie auf Verletzen, um die Platte einzurücken.
Klicken Sie auf Oben, um die Bühne nach oben zu verschieben, klicken Sie auf Stopp, wenn sich die Platte in der oberen Position befindet, und öffnen Sie die Tür, um die Verletzungsvorrichtung zu deaktivieren. Überprüfen Sie dann die Verschiebungshistorie des Tisches, die im virtuellen Instrument "Position Tracker" angezeigt wird, um zu bestätigen, dass die angegebene maximale Verschiebung angewendet wurde, und exportieren Sie die Daten in ein geeignetes Tabellenkalkulationsprogramm.
Um die Dehnung der Silikonmembran nach der Plasmabehandlung zu beurteilen, legen Sie die Platte auf eine weiche Oberfläche und grundieren Sie den kleinen Vorsprung auf einem Stempel mit Tinte von einem Permanentmarker. Führen Sie den Stempel in die erste Vertiefung ein, die getestet werden soll, und klopfen Sie, um eine gute Farbübertragung zu gewährleisten. Wenn alle Vertiefungen gestanzt sind, platzieren Sie eine Hochgeschwindigkeitskamera auf einem Auslegerstativ über dem Verletzungsgerät, wobei das Objektiv auf die kleinste nummerierte Blendenzahl eingestellt ist, so dass das Sichtfeld 12 Eindringkörper in einem 3x4-Raster enthält.
Wenn sich die Platte in der Nullpunktposition befindet, klicken Sie einmal auf die Aufnahmetaste in der Kamerasoftware, sodass "Trigger In" angezeigt wird, und schalten Sie das helle, diffuse axiale Licht ein, drücken Sie dann die Platte wie gerade gezeigt ein und schalten Sie das axiale Licht aus.
Um eine Zellkultur zu schädigen, geben Sie 100 Mikroliter mit Laminin behandelte humane induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Neuronen in jede Vertiefung der plasmabehandelten Platte und lassen Sie die Zellen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur an der Plattenunterseite anhaften, bevor Sie die Platte in den Zellkultur-Inkubator legen. Klemmen Sie die Platte nach 2 bis 3 Tagen Kultur auf den Tisch des Verletzungsgeräts und passen Sie die Position des Deckels an, um die Platte zu sichern, ohne die Kulturen der Umgebungsluft auszusetzen. Ziehen Sie dann die Platte in der Nullpunktposition ein, wie gerade gezeigt.
Übersicht
In diesem Artikel wird eine Methode beschrieben, mechanische Spannung auf aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitete Neuronen (hiPSCNs) auszuüben, um zelluläre Reaktionen zu untersuchen. Das Verfahren beinhaltet die Verwendung einer Mehrfachbrunnenplatte mit einer Silikonmembran, um eine kontrollierte Eindrückung durchzuführen und so eine Dehnungsverletzung zu simulieren.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Mechanobiologie
Hintergrund
- hiPSCNs sind wertvoll für die Untersuchung des neuronalen Verhaltens und der Verletzungsreaktionen.
- Mechanische Belastung kann zelluläre Strukturen stören und liefert somit Erkenntnisse über Verletzungsmechanismen.
- Das Verständnis dieser Prozesse ist entscheidend für die Entwicklung therapeutischer Strategien bei neurodegenerativen Erkrankungen.
- Die Verwendung von Biopolymeren und ECM-Proteinen verbessert die Zelladhäsion und sorgt so für experimentelle Konsistenz.
Zweck der Studie
- Untersuchung der Auswirkungen mechanischer Belastung auf hiPSCNs.
- Analyse der resultierenden zellulären Veränderungen, einschließlich Zytoskelettdisruption und Zelltod.
- Entwicklung einer reproduzierbaren Methode zur Untersuchung neuronaler Verletzungen in vitro.
Verwendete Methoden
- Herstellung einer Mehrfach-Well-Platte mit einer Silikonmembran und Biopolymerbeschichtung.
- Einführung von in einem mit ECM-Proteinen angereicherten Medium suspendierten hiPSCNs.
- Aufbringung kontrollierter mechanischer Belastung mithilfe eines Verletzungsgeräts.
- Beurteilung zellulärer Reaktionen durch Bildgebung und Datenanalyse.
Hauptergebnisse
- Mechanische Belastung führte zur Degeneration der Neuriten und zum Zelltod in hiPSCNs.
- Veränderungen der Zellmorphologie wurden nach der Verletzung beobachtet.
- Die Daten bestätigten die Wirksamkeit des Verletzungsmodells zur Untersuchung neuronaler Reaktionen.
- Die Hochgeschwindigkeitsaufnahme ermöglichte Einblicke in die Dynamik der zellulären Verletzung.
Schlussfolgerungen
- Die Studie demonstriert erfolgreich eine Methode zur Induktion und Analyse von Dehnverletzungen in hiPSCNs.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis der zellulären Mechanismen neuronaler Verletzungen bei.
- Dieses Modell kann für zukünftige Forschungen zu neurodegenerativen Erkrankungen und potenziellen Therapien genutzt werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Modellierung von Dehnverletzungen in aus humanen iPSCs abgeleiteten Neuronen ermöglicht die Risikominderung neurotraumatischer Zielstrukturen in einem frühen Stadium und unterstützt die prädiktive Bewertung neuronaler Verletzungsmechanismen. Dieses In-vitro-System bietet eine skalierbare, menschennahe Plattform, um zelluläre Reaktionen auf mechanische Belastung zu untersuchen und die Zielstrukturenvalidierung sowie translationsmedizinische Forschung voranzutreiben. Seine quantitativen Ausgangsparameter erleichtern Portfolioentscheidungen in Entwicklungsprogrammen zu Neurodegeneration und ZNS-Verletzungen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die mechanistische Untersuchung von neuronale Verletzungswege in einem kontrollierten, auf menschlichen Zellen basierenden System.
- Unterstützt die funktionelle Target-Validierung durch Quantifizierung von Zytoskelett-Störungen und Zelltod-Phänotypen.
- Erleichtert die Vorhersagegenauigkeit in frühen neurotraumatischen und neurodegenerativen Programmen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bietet ein reproduzierbares Mehrfach-Well-Format für standardisierte Verletzungsinduktion und -analyse.
- Erzeugt quantitative Messwerte, die für die Assay-Entwicklung und Screening-Workflows von Verbindungen geeignet sind.
- Ermöglicht Skalierbarkeit und Wiederverwendung der Plattform für High-Content-Screenings neuroprotektiver Wirkstoffe.
Translationale und präklinische Forschung
- Entspricht krankheitsrelevanten Verletzungsmechanismen, die bei traumatischer Hirnverletzung und Neurodegeneration beobachtet werden.
- Ermöglicht Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung durch Modellierung menschlicher neuronaler Reaktionen.
- Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung von neurotherapeutischen Kandidaten basierend auf menschlich relevanten Daten.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses in-vitro-Streckverletzungsmodell fügt sich in den Kontinuum von der frühen Entdeckung bis zur präklinischen Phase ein und verbindet die Zielvalidierung mit der translationellen Forschung in den Bereichen ZNS-Verletzung und Neurodegeneration.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung verletzungsinduzierter neuronaler Phänotypen und der Beteiligung von Signalwegen.
- Screening: Liefert standardisierte, quantitative Ergebnisse zum Vergleich der Wirkung von Substanzen auf Verletzungsphänotypen.
- Analytik: Bietet bildgebende Verfahren mit hohem Informationsgehalt und Verschiebungsdaten für eine robuste statistische Analyse.
- Translationale Forschung: Modelliert für den Menschen relevante Verletzungsmechanismen, um die Entwicklung von Biomarkern und Therapeutika zu unterstützen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine skalierbare Plattform mit Mehrfachbrunnen, die für verschiedene Forschungsteams in der Neurobiologie anpassbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unschärfen in Studien zu neuronaler Verletzung.
- Operativer Wert: Standardisiert die Induktion und Analyse von Verletzungen, um Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit zu gewährleisten.
- Strategischer Wert: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen und reduziert biologische Risiken in fortgeschrittenen Phasen neurotherapeutischer Portfolioentwicklungen.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Programmen zu ZNS-Verletzungen und Neurodegeneration.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Kultur humaner iPSCs und der neuronalen Differenzierung.
- Benötigt spezialisierte Instrumente für kontrollierte mechanische Belastung und Hochgeschwindigkeitsaufnahmen.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen hinsichtlich Verletzungsparameter und Datenanalyse-Workflows.
- Kann bei Optimierung des Protokolls an verschiedene neuronale Subtypen und Verletzungsschweregrade angepasst werden.
- Zu den Einschränkungen gehören der In-vitro-Kontext und das Fehlen systemischer Faktoren, die in vivo vorhanden sind.
Biopharma-Häufige Fragen
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Zuletzt aktualisiert: 29 August 2026