Messung des Retinsäurespiegels in Neurosphären mit Hilfe einer Retinsäure-Reporterzelllinie

Nehmen Sie eine adhärente Kultur von Retinsäure (RA)-Reporterzellen.

Diese Zellen tragen ein transgenes Konstrukt, das das lacZ-Gen enthält, das für die β-Galactosidase kodiert, die durch das Retinsäure-Reaktionselement (RARE) reguliert wird.

Züchten Sie dissoziierte Zellen, die aus Neurosphären von Stammzellen des Rückenmarks der Maus gewonnen wurden. Ausbrüten.

Die Neurosphärenzellen setzen RA frei, die in die Reporterzellen eindringt und an ihren Rezeptorkomplex auf RARE bindet.

Dies löst die Bildung eines transkriptionellen Aktivatorkomplexes aus, der die β-Galactosidase-Expression einleitet.

Ersetzen Sie das Medium durch ein Fixiermittel, um die Zellmorphologie zu erhalten.

Entfernen Sie das Fixiermittel und waschen Sie es mit einem Puffer.

Fügen Sie einen Permeabilisierungspuffer hinzu, um die Zellmembranen zu permeabilisieren.

Ein β-Galactosidase-Substrat einbringen und inkubieren.

Das Substrat gelangt in die Reporterzellen, wo es von β-Galactosidase zu einem instabilen Produkt hydrolysiert wird, das oxidiert und dimerisiert und einen blau gefärbten Niederschlag bildet.

Mit einem Puffer waschen.

Messen Sie mit einem Mikroplatten-Reader die Absorption und vergleichen Sie sie