Immunfluoreszenzfärbung neuronaler Populationen im embryonalen gastrointestinalen Trakt der Maus

0 Ansichten2:58 Min. • July 8th, 2025

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Nehmen Sie einen fixierten, transgenen embryonalen Magen-Darm-Trakt der Maus im gewünschten Entwicklungsstadium

.

Das enterische Nervensystem des Magen-Darm-Trakts umfasst enterische Neuronen und cholinerge Neuronen, die Cholinacetyltransferase exprimieren.

Diese cholinergen Neuronen exprimieren auch ein fluoreszierendes Protein, das vom Cholin-Acetyltransferase-Promotor angetrieben wird.

Inkubieren Sie den Trakt mit einem nichtionischen Detergens und Proteinen, um die Zellen zu permeabilisieren und eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern.

Durch Primärantikörper ersetzen. Inkubieren Sie, damit die Antikörper ihre Zielproteine in den Neuronen binden können.

Entfernen Sie die ungebundenen Antikörper und waschen Sie sie mit Puffer.

Inkubieren Sie mit Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpern, um die an Zielproteine gebundenen Primärantikörper spezifisch zu binden.

Entfernen Sie die überschüssigen Antikörper und waschen Sie sie mit Puffer ab.

Tauchen Sie den markierten Trakt in Einbettmedien, die einen Kernfarbstoff enthalten, um die Kerne zu färben. Montieren Sie nun ein Deckglas.

Mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie können Sie die Verteilung cholinerger Neuronen im Magen-Darm-Trakt visualisieren und analysieren.

Geben Sie die Magen-Darm-Trakte in ein 0,2-Milliliter-Röhrchen mit Blockierungslösung, bestehend aus 1x PBS, 3% Rinderserumalbumin, 0,1 Triton X-100, und wiegen Sie es 1 Stunde lang bei Raumtemperatur. Nach dem Blockieren wird die Blockierungslösung mit einer Pasteur-Pipette mit feiner Spitze aspiriert und durch die optimale Verdünnung der in der Blockierungslösung verdünnten Primärantikörper ersetzt.

Inkubieren Sie entweder vier Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 Grad Celsius auf der Schaukelplattform. Nach der primären Antikörperinkubation aspirieren Sie die Antikörperlösung und spülen Sie die Magen-Darm-Trakte dreimal jeweils fünf Minuten lang in PBS und dann eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter Schaukeln.

Ersetzen Sie das PBS nach dem letzten Waschen durch Fluorophor-konjugierte Sekundärantikörper, die in Blockierungslösung verdünnt sind, und legen Sie die Röhrchen vier Stunden lang bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 Grad Celsius im Dunkeln auf die Schaukelplattform.

Nachdem Sie die GI-Gänge wie zuvor gewaschen haben, geben Sie einige Tropfen Fluoreszenz-Eindeckmedium mit DAPI auf einen Objektträger, tauchen Sie dann den GI-Trakt in das Eindeckmedium und fügen Sie ein Deckglas hinzu. Nehmen Sie abschließend Bilder jedes Fluorophors mit einem konfokalen Mikroskop auf und führen Sie dann eine computergestützte Bildanalyse mit geeigneter Software durch.

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Zuletzt aktualisiert: 22 August 2026