Eine virale Vektorinjektion in die Substantia nigra der Ratte zur Modellierung neurodegenerativer Erkrankungen

Sichern Sie eine anästhesierte Ratte in einem stereotaktischen Rahmen.

Desinfizieren Sie die Kopfhaut und machen Sie einen Schnitt in der kranialen Mittellinie, um den Schädel freizulegen.

Identifizieren Sie das Bregma und das Lambda, zwei Referenzpunkte am Schädel, um die Injektionsstelle zu bestimmen.

Bereiten Sie eine Mikroinjektionsspritze vor, die eine virale Vektorsuspension enthält.

Der virale Vektor trägt ein Transgen, das für Alpha-Synuclein kodiert, ein Protein, das bei neurodegenerativen Erkrankungen in den Neuronen der Substantia nigra eine Fehlfaltung und Aggregation erfährt.

Positionieren Sie die Spritze in dem stereotaktischen Instrument, das an eine Mikroinjektionspumpe angeschlossen ist.

Erstellen Sie ein Bohrloch an der Injektionsstelle, um Hirnverletzungen zu vermeiden.

Dringen Sie mit einer Nadel in die Dura ein und reinigen Sie das Blut mit sterilem Gewebe.

Führen Sie die Mikroinjektionsnadel durch das Bohrloch ein, um die Substantia nigra zu erreichen.

Injizieren Sie die Virussuspension langsam und sorgen Sie für eine gleichmäßige Verteilung.

Halten Sie kurz inne, um einen Rückfluss zu verhindern, und ziehen Sie die Nadel dann langsam zurück.

Nähen Sie den Schnitt.

Das Modell ist nun bereit für die weitere Analyse.

Beginnen Sie mit der ordnungsgemäßen Betäubung einer acht Wochen alten weiblichen Wistar-Ratte nach genehmigten Protokollen. Überprüfen Sie, ob ein chirurgischer Anästhesieplan erreicht wurde, indem Sie jede Pfote zusammendrücken und feststellen, dass der Entzugsreflex fehlt. Verwenden Sie als Nächstes einen Mikrotransponder-Implanter, um einen Mikrotransponder auf dem Rücken der Ratte zu platzieren. Prüfen Sie, ob der Mikrotransponder richtig positioniert ist und ob eine Auslesung möglich ist.

Schneiden Sie nun die Haare auf der Kopfhaut der Ratte ab und tragen Sie ein Lokalanästhetikum auf die Kopfhaut und die Ohren auf. Bringen Sie die Ratte in eine Laminar-Flow-Haube und führen Sie den Rest des Eingriffs mit aseptischer Technik durch. Platzieren Sie die Ratte in den stereotaktischen Rahmen, indem Sie die Ohrstangen sichern, gefolgt von der Mund- und Nasenstange. Decken Sie den Körper der Ratte mit einer Papierdecke ab, um ein Absinken der Körpertemperatur zu vermeiden. Tragen Sie ein Augengleitmittel auf, um ein Austrocknen der Augen zu verhindern.

Als nächstes desinfizieren Sie die Kopfhaut nach zugelassenen Verfahren. Hier wird 1% Jod in 70% Isopropanol verwendet. Nachdem Sie einen kleinen Schnitt in der Mittellinie der Kopfhaut gemacht haben, kratzen Sie vorsichtig die Membranen am Schädel ab und spülen Sie sie mit Kochsalzlösung ab. Nachdem Sie den Schädel trocknen lassen, stellen Sie sicher, dass Bregma und Lambda deutlich zu sehen sind.

Füllen Sie nun eine 10-Mikroliter-Mikroinjektionsspritze mit einem Fassungsvermögen von 20 Millimetern und einem Gewicht von 30 Gauge mit rekombinantem AAV und legen Sie sie auf die motorisierte Mikroinjektionspumpe, die mit dem stereotaktischen Instrument verbunden ist.

Für die spezifische Transduktion der dopaminergen Neuronen der Substantia nigra sind rekombinante AAV-Vektoren aufgrund ihrer hohen Titer und ihrer Effizienz bei der Transduktion dopaminerger Neuronen die erste Wahl.

Testen Sie den Durchfluss, indem Sie einen Tropfen AAV freisetzen. Entsorgen Sie freigesetztes AAV in einem mehrwertigen Reinigungsmittel. Überprüfen Sie visuell, ob der Kopf gerade im Kopfrahmen befestigt ist. Überprüfen Sie dann, ob der Schädel flach ist, indem Sie zuerst die Spitze der Nadel zum Bregma bewegen und die Höhe an dieser Stelle messen, indem Sie die Spitze der Nadel in dorsoventraler Richtung absenken, bis sie den Schädel berührt. Wiederholen Sie den Vorgang bei lambda.

Nachdem Sie die Nadel wieder in das Bregma zurückgebracht haben, bewegen Sie die Nadel in anteroposteriorer und mediolateraler Richtung zu den stereotaktischen Koordinaten für die Mikroinjektion. Notieren Sie sich die Koordinaten. Messen Sie an der Injektionsstelle wie zuvor die Höhe des Schädels und stellen Sie sicher, dass sie nicht mehr als 0,3 Millimeter von der Höhe des Bregmas abweicht.

Bohren Sie dann vorsichtig ein 2 Millimeter großes Loch in den Schädel. Sobald das Loch gebohrt ist, messen Sie die Höhe der Dura, um die Referenz zu bestimmen, von der aus die dorsoventrale Koordinate angewendet werden soll. Stechen Sie mit einer 26-Gauge-Nadel in die Dura ein. Nehmen Sie jegliches Blut mit einem sterilen Gewebe auf und fahren Sie erst fort, wenn alle Blutungen aufgehört haben.

Senken Sie nun die Nadel der vorgeladenen Mikroinjektionsspritze langsam in das Gehirn bis zur dorsalen ventralen Koordinate ab und pausieren Sie eine Minute lang. Injizieren Sie dann drei Mikroliter AAV mit einer Geschwindigkeit von 0,25 Mikrolitern pro Minute. Lassen Sie die Nadel nach der Injektion weitere fünf Minuten an Ort und Stelle, um einen Rückfluss entlang der Nadelschiene zu verhindern, bevor Sie sie langsam entfernen.

Nähen Sie die Kopfhaut mit beschichtetem, geflochtenem Polyester 3.0 und desinfizieren Sie die Haut mit 1 % Jod in 70 % Isopropanol, um den Nasen- und Mundbügel zu lockern, und dann die beiden Ohrstangen, um das Tier vorsichtig aus dem stereotaktischen Instrument zu entfernen. Verabreichen Sie zu diesem Zeitpunkt eine Analgesie und, falls erforderlich, ein Anästhesieumkehrmittel. Setzen Sie die Ratte dann in einen sauberen Käfig auf eine auf 38 Grad Celsius eingestellte Heizplatte und überwachen Sie sie genau, bis sie aufwacht.