Isolierung von detergenzien-unlöslichen Proteinaggregaten aus menschlichem postmortalem Hirngewebe

Beginnen Sie mit einer gefrorenen postmortalen menschlichen Hirngewebeprobe aus einem bestätigten Fall von neurodegenerativer Erkrankung.

Excise graue Substanz, die reich an unlöslichen Proteinaggregaten ist, ein Kennzeichen der Krankheit.

Übertragen Sie das Gewebe in einen Homogenisator.

Fügen Sie einen Puffer hinzu, der Inhibitoren enthält, und homogenisieren Sie, um intrazelluläre Komponenten freizusetzen.

Die Inhibitoren blockieren Protease- und Phosphatase-Enzyme und verhindern so den Proteinabbau.

Füllen Sie das Homogenat in ein Röhrchen und fügen Sie einen ionischen Detergenspuffer hinzu. Ausbrüten.

Das Detergens löst nativ gefaltete Proteine auf, während fehlgefaltete Proteinaggregate intakt bleiben.

Beschallt, um die zelluläre Dissoziation zu vervollständigen.

Übertragen Sie das Homogenat in ein Ultrazentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie es mit hoher Geschwindigkeit.

Die Zuschlagstoffe setzen sich am Boden ab.

Entfernen Sie den Überstand, der waschmittellösliche Proteine enthält.

Waschen Sie die Zuschlagstoffe mit einem ionischen Waschmittelpuffer, zentrifugieren Sie sie und entfernen Sie den Überstand.

Fügen Sie Harnstoffpuffer hinzu, um die Proteinaggregate zu denaturieren und löslich zu machen.

Die gelösten Proteinaggregate werden in ein Röhrchen überführt und kurz beschallt, um eine vollständige Auflösung zu gewährleisten.

Gewinnung von gefrorenem postmortalem Hirngewebe aus gesunder Kontrolle und pathologisch bestätigter Alzheimer-Substanz. Verwenden Sie eine Pinzette und eine Rasierklinge, um etwa 250 Milligramm Teile der grauen Substanz aus jeder Gewebeprobe herauszuschneiden. Lassen Sie das Gehirnsegment eine Minute lang auftauen. Würfeln Sie nun ein Stück Taschentuch beim Auftauen in etwa zwei Millimeter große Würfelstücke. In ein zwei Milliliter vorgekühltes Dounce-Homogenisatorröhrchen auf Eis umfüllen.

Denken Sie daran, die weiße Substanz und große Blutgefäße zu vermeiden.

Arbeiten Sie schnell und legen Sie das Taschentuch auf Einweg-Tränenwaagen. Achten Sie darauf, dass das Gewebe nicht auftaut, indem Sie das Wiegeschiffchen mit Hirngewebe häufig in Styroporbehälter mit Trockeneis legen. Nachdem Sie alle erforderlichen Gewebestücke präpariert und gewogen haben, nehmen Sie ein Waagscherchen mit einem Stück Gewebe aus dem Trockeneis.

Als nächstes fügen Sie fünf Milliliter eiskalten salzarmen Puffer mit Protease- und Phosphatasehemmer-Cocktail pro Gramm Gewebe hinzu und homogenisieren Sie auf Eis mit etwa 10 Zügen Stößel A mit hoher Clearance und 15 Strichen Stößel B mit niedriger Clearance. Verwenden Sie dann eine neun Zoll große Pasteurpipette aus Glas, um jedes Homogenat in ein beschriftetes Zwei-Milliliter-Polypropylenröhrchen zu übertragen. Das verbleibende Homogenat wird in ähnlicher Weise in zusätzliche markierte 1,5-Milliliter-Röhrchen für die Lagerung bei -80 Grad Celsius aliquotiert.

Um mit der Fraktionierung fortzufahren, fügen Sie 100 Mikroliter fünfmolares Natriumchlorid und 100 Mikroliter 10 % Sarkosyl zu jedem 0,8-Millimeter-Aliquot hinzu. Durch Inversion gut mischen und dann 15 Minuten auf Eis inkubieren. Verwenden Sie nach der Inkubation ein Ultraschallgerät, das mit einer Mikrospitzensonde ausgestattet ist, um drei 5-Sekunden-Impulse mit 30 % Amplitude abzugeben.

Nachdem die Bicinchoninsäure-Methode zur Bestimmung der Proteinkonzentrationen der Homogenate verwendet wurde, wird jeder Probe eiskalter Sark-Puffer mit Protease- und Phosphatase-Inhibitoren bis zu einer Endkonzentration von 10 Milligramm pro Millimeter zugesetzt. Übertragen Sie dann 500 Mikroliter jeder Probe in 500-Mikroliter-Polycarbonat-Ultrazentrifugenröhrchen.

Laden Sie die Röhrchen in einen vorgekühlten Rotor und zentrifugieren Sie sie 30 Minuten lang bei 4 Grad Celsius mit 180.000 g ultrazentrifugieren. Nach der Zentrifugation werden die löslichen S1-Sarkosylüberstände in 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt und bei -80 Grad Celsius gelagert. Geben Sie 200 Mikroliter Sarkpuffer in die Ultrazentrifugenröhrchen, die die unlöslichen P1-Fraktionen enthalten, und lösen Sie die Pellets mit der Pipettenspitze vom Boden der Ultrazentrifugenröhrchen.

Übertragen Sie anschließend die resuspendierten P1-Pellets in neue 500-Mikroliter-Ultrazentrifugenröhrchen, balancieren Sie das Paar und zentrifugieren Sie bei 180.000 g für weitere 30 Minuten bei 4 Grad Celsius. Entsorgen Sie den S2-Überstand, fügen Sie dann 50 bis 75 Mikroliter Harnstoffpuffer mit Protease und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail zu den Sarkosyl-unlöslichen Pellets hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, um das P2-Pellet zu lösen.

Nach der Inkubation werden die resuspendierten P2-Pellets in markierte 0,5-Millimeter-Röhrchen überführt und die Pellets mit einer kurzen 1-Sekunden-Mikrospitzenbeschallung bei 20 % Amplitude vollständig gelöst. Bestimmen Sie die Proteinkonzentrationen der löslichen und unlöslichen Sarkosylfraktionen unter Verwendung der BCA-Assay-Methode.