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Nehmen Sie perfundiertes ischämisches Hirngewebe von Mäusen, das Gehirnzellen und infiltrierte Immunzellen enthält.
Das Taschentuch auf einem Sieb zerkleinern und mit Puffer abspülen.
Das Filtrat zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
Suspendieren Sie das Pellet in einer Verdauungsenzymlösung und geben Sie es in ein Mikrozentrifugenröhrchen.
Inkubieren Sie für die Verdauungsenzyme, um die extrazelluläre Matrix aufzubrechen und die Zellen zu lockern.
Die Suspension filtrieren und mit DNase-haltigem Puffer spülen, um kontaminierende DNA zu entfernen.
Anschließend mit DNase-freiem Puffer waschen.
Das Filtrat zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
Resuspendieren Sie die Zellen in einem Dichtegradientenmedium. Dann den Inhalt in eine frische Tube geben und mischen. Zentrifuge, um die Komponenten nach Dichte zu trennen.
Entfernen Sie den Überstand, der Myelin und Schmutz enthält.
Resuspendieren Sie das Pellet in einem DNase-freien Puffer. Füllen Sie es in ein neues Röhrchen um und zentrifugieren Sie es erneut.
Der Überstand ist zu verwerfen, um eine ausreichende Entfernung des Dichtegradientenmediums sicherzustellen.
Zum Schluss resuspendieren Sie die Zellen für die weitere Analyse in Puffer.
Mit dem Kolbenende einer 5-Milliliter-Spritze die Hirngewebestücke durch ein 100-Mikron-Zellsieb zerdrücken und das Sieb kontinuierlich mit eiskaltem HBSS mit Kalzium und Magnesium spülen. Legen Sie dann die homogenisierten Gewebe auf Eis.
Wenn alle Proben verarbeitet wurden, schleudern Sie die Zellsuspensionen herunter. Und entsorgen Sie die Überstände vorsichtig. Die Pellets werden in 1 Milliliter Aufschlusspuffer resuspendiert. Übertragen Sie dann die Zellsuspension in ein 2-Milliliter-Röhrchen.
Und inkubieren Sie die Zellen unter langsamer, kontinuierlicher Rotation bei 37 Grad Celsius. Nach einer Stunde wird die Zellsuspension durch ein 70-Mikron-Zellsieb gesiebt. Und spülen Sie den Filter gründlich mit 3 Millilitern Waschpuffer aus, der DNase enthält. Anschließend das Sieb mit 15 Millilitern DNase-freiem Waschpuffer waschen. Schleudern Sie die Zellen herunter und verwerfen Sie den Überstand.
Um die Zelltrümmer und das Myelin zu entfernen, resuspendieren Sie die Zellen in 5 Millilitern Raumtemperatur mit 25 % Dichtegradientenmedium und überführen Sie die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Mischen Sie die Zellen und den Gradienten gründlich durch wiederholtes sanftes Pipettieren. Schleudern Sie dann die Zelllösung herunter.
Am Ende der Trennung wird das Myelinfell und der Überstand vorsichtig abgesaugt, ohne das Pellet zu stören. Und resuspendieren Sie die Zellen in 10 Millilitern DNase-freiem Waschpuffer. Übertragen Sie die Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen und schleudern Sie sie wieder herunter, wobei Sie das Pellet in 100 Mikrolitern Kaltwaschpuffer resuspendieren.