JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Neurowissenschaften
0 Aufrufe • 2:04 Min. • July 8th, 2025
Beginnen Sie mit einem Objektträger, der einen dünnen Schnitt eines kortikalen Organoids enthält, das Gliazellen und Neuronen in verschiedenen Stadien des Alterns enthält.
Die alternden Neuronen, die sich in einem Zustand der Seneszenz mit abnehmender Zellfunktion befinden, enthalten einen hohen Gehalt an Beta-Galactosidase.
Die Sektion wird mit einem Fixiermittel zur Stabilisierung der Zellstruktur und einem Permeabilisierungsmittel zur Permeabilisierung der Membranen vorbehandelt.
Legen Sie den Objektträger in einen Färbebehälter, um ihn mit einem Puffer zu waschen, um alle Lösungsspuren zu entfernen.
Färben Sie den Objektträger mit einer Lösung, die ein Substrat für das Beta-Galactosidase-Enzym enthält, und inkubieren Sie.
Das Substrat dringt in die Zellen ein, wo Beta-Galactosidase das Substrat spaltet und ein blaues Produkt erzeugt, das sich mehr in den alternden Neuronen ansammelt.
Waschen Sie den Abschnitt wiederholt.
Fügen Sie ein Antifading-Eindeckmittel hinzu und lassen Sie es sich verfestigen, um die Unversehrtheit des befleckten Abschnitts zu gewährleisten.
Betrachten Sie den Objektträger unter einem Mikroskop; der Bereich mit einem intensiv blauen Produkt zeigt die alternden Neuronen im Organoid an.
Entfernen Sie nach der Kryosektion der Organoide die überschüssige Einbettlösung, indem Sie die Objektträger in einen Objektträgerbehälter mit Deckel überführen und das geschnittene Organoidgewebe dreimal 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit PBS waschen. Inkubieren Sie die Objektträger dann über Nacht bei 37 Grad Celsius mit frisch hergestellter Beta-Galactosidase-Färbelösung. Waschen Sie die gefärbten Tücher dreimal mit PBS für jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur, um die Beta-Galactosidase-Lösung zu entfernen.
Montieren Sie nun das gewaschene Gewebe mit einem Glas-Antifading-Eindeckmittel und lassen Sie die Eindecklösung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur erstarren, bevor Sie sie unter dem Mikroskop betrachten.