JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Neurowissenschaften
0 Aufrufe • 2:36 Min. • July 8th, 2025
Nehmen wir einen fixierten Hippocampus-Schnitt der Ratte, der ein Interneuron enthält, das mit Biocytin, einem Biotin-konjugierten Molekül, gefüllt ist.
Fügen Sie als Nächstes eine Lösung hinzu, die blockierende Proteine und ein nichtionisches Detergens enthält, um eine unspezifische Bindung zu verhindern und Neuronen zu permeabilisieren.
Inkubieren Sie mit einem primären Antikörper, der auf spezifische Cannabinoidrezeptoren auf Interneuronen abzielt.
Mit Puffer waschen, um überschüssige Antikörper zu entfernen.
Fügen Sie dann einen Streptavidin-konjugierten Fluoreszenzfarbstoff und einen Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper hinzu.
Während der Inkubation bindet Streptavidin stark an Biocytin, was die Visualisierung des mit Biocytin gefüllten Interneurons ermöglicht, während der sekundäre Antikörper auf rezeptorgebundene primäre Antikörper auf den Interneuronen abzielt.
Mit Puffer spülen und ungebundene Moleküle entfernen.
Montieren Sie nun den Abschnitt mit wässrigen Einbettmedien. Positionieren Sie ein Deckglas und versiegeln Sie es.
Visualisieren Sie mit einem Fluoreszenzmikroskop die Expression des mit Biocytin gefüllten Interneurons und des Cannabinoidrezeptors, was eine Analyse der Morphologie und Rezeptorverteilung des Interneurons ermöglicht.
Verschließen Sie das Gewebe eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit 10% blockierendem Serum. Anschließend werden die Abschnitte im primären Antikörper CB1R über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert, um die Expression des Cannabinoidrezeptors Typ 1 zu identifizieren. Waschen Sie dann die Gehirnabschnitte dreimal für jeweils 10 Minuten in 0,1 molaren PBS. Streptavidin und der Sekundärantikörper gegen den ersten Primärantikörper werden beide in die Well-Platte gegeben und über Nacht bei vier Grad Celsius aufbewahrt.
Anschließend werden die Abschnitte in einem Konjugat mit dem roten Farbstoff Streptavidin über Nacht bei vier Grad Celsius im Dunkeln inkubiert, um das Biocytin freizulegen. Waschen Sie danach die Hirnabschnitte dreimal für jeweils 10 Minuten in 0,1 molaren PBS. Um die Fluoreszenz zu schützen und das Nachfärben in Zukunft zu erleichtern, montieren Sie die Abschnitte in ein wässriges Einbettmedium und versiegeln Sie die Ränder der Deckgläser mit klarem Nagellack.