Immunhistochemische Färbung des S-100-Proteins in humanen rektalen Saugbiopsieschnitten

Nehmen Sie feste rektale Saugbiopsieschnitte beim Menschen mit exponierten Proteinantigenen und inaktivierten endogenen Peroxidasen.

Fügen Sie eine Blockierungslösung hinzu, um eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern.

Ersetzen Sie die Blockierungslösung durch primäre Antikörper, die an das Zielprotein der Gliazelle, S-100, binden, einen Marker für Morbus Hirschsprung.

Entfernen Sie ungebundene Antikörper und inkubieren Sie mit Peroxidase-Polymeren, um das Signal zu verstärken.

Waschen, um überschüssiges Polymer zu entfernen. Fügen Sie Sekundärantikörper hinzu, die an Enzympolymere und Primärantikörper binden.

Entfernen Sie ungebundene Antikörper und fügen Sie ein chromogenes Substrat hinzu.

Die Peroxidasen reagieren mit dem Substrat und bilden einen farbigen Niederschlag.

Spülen Sie, um überschüssigen Niederschlag zu entfernen.

Füge einen Farbstoff hinzu, um die Zellkerne zu färben.

Mit einer Säure-Ethanol-Lösung waschen, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen.

Als nächstes dehydrieren Sie die Abschnitte mit steigenden Konzentrationen von Ethanol, gefolgt von Xylol.

Zum Schluss montieren und unter einem Mikroskop beobachten, um die Färbung zu visualisieren, die auf das Vorhandensein des Zielproteins hinweist.

Das überschüssige Rinderserumalbumin wird verworfen und die Zellen über Nacht mit 50 Mikrolitern des primären Antikörpers bei 4 Grad Celsius markiert. Spülen Sie die Objektträger am nächsten Morgen mit drei dreiminütigen Wäschen in PBS aus und fügen Sie jedem Objektträger 50 Mikroliter Polymerverstärker hinzu. Waschen Sie die Objektträger nach 20 Minuten bei 37 Grad Celsius dreimal in PBS und geben Sie 50 Mikroliter Sekundärantikörper B in jeden Gewebeschnitt.

Spülen Sie die Abschnitte nach 30 Minuten bei 37 Grad Celsius mit drei fünfminütigen Wäschen in PBS ab und geben Sie einen Tropfen frisch zubereiteter DAB-Arbeitslösung auf jeden Objektträger. Wenn der entsprechende Grad der Braunfärbung durch Lichtmikroskopie festgestellt wird, spülen Sie die Objektträger fünf Minuten lang in PBS und färben Sie die Zellkerne eine Minute lang mit einem Tropfen Hämatoxylin gegen.

Entfernen Sie den überschüssigen Fleck etwa 30 bis 40 Sekunden lang unter einem Rinnsal Wasser, gefolgt von einer 25- bis 30-sekündigen Wäsche in frischem PBS. Differenzieren Sie das Gewebe 10 Sekunden lang in 1 % Salzsäure-Ethanol, gefolgt von einer einminütigen PBS-Wäsche.

Dehydrieren Sie die Objektträger mit fünfminütigen Immersionen in umgekehrter Reihenfolge der Hydratation und setzen Sie die Objektträger zwei fünfminütigen Xylolwechseln aus. Montieren Sie dann das Deckglas mit einer ultracleanen Halterung und lassen Sie die Objektträger trocknen, bevor Sie sie auf einem Lichtmikroskop sichtbar machen.