Induktion einer gezielten neuronalen Schädigung mit einem Hochleistungslaser in einer Drosophila-Larve

Legen Sie eine betäubte Drosophila-Larve mit dem Kopf nach oben auf einen Öltropfen auf einem Objektträger mit Vakuumfettflecken.

Positionieren Sie ein Deckglas und drücken Sie es vorsichtig an, um Kontakt mit der Larve aufzunehmen.

Passen Sie die Larve so an, dass die Region freigelegt wird, in der sich die Zielneuronen befinden, die fluoreszierende Proteine exprimieren.

Befestigen Sie den Objektträger an einem Zwei-Photonen-Mikroskop.

Verwenden Sie einen Laser mit geringer Leistung, um Schäden zu minimieren, und scannen Sie die Larve, um die Region mit den fluoreszierenden Zielneuronen zu lokalisieren.

Passen Sie als Nächstes das Scanfenster so an, dass es sich auf die Zielregion konzentriert, die Axone enthält, eine Art neuronaler Projektionen.

Reduzieren Sie nun die Abtastrate und erhöhen Sie die Laserleistung.

Der Hochleistungslaser trifft auf die anvisierten Axone und erzeugt eine lokale Wärme, die sie schädigt und die Fluoreszenz um die Verletzungsstelle herum verstärkt.

Wechseln Sie schließlich wieder in den Lasermodus mit geringer Leistung. Das Vorhandensein kleiner, kraterartiger, ringförmiger Strukturen an der Verletzungsstelle bestätigt die erfolgreiche neuronale Schädigung.

Beginnen Sie mit der Betäubung der Larven. Stellen Sie in einem Abzug eine 60-Millimeter-Glasschale in eine 15 Zentimeter große Petrischale aus Kunststoff. Falten Sie dann ein Stück Seidenpapier und legen Sie es in die Glasschale. Legen Sie die Trauben-Agar-Platte auf das Gewebe, nachdem der Diethylether hinzugefügt wurde. Geben Sie dann auf einen Objektträger einen Tropfen Halogenkohlenwasserstoff 27 Öl in die Mitte und geben Sie einen Fleck Vakuumfett auf jede der vier Ecken.

Übertragen Sie dann mit einer Pinzette eine Larve auf die Agarplatte und decken Sie die Glasschale ab, um die Larve zu betäuben. Sobald sich die Larve nicht mehr bewegt, setzen Sie sie vorsichtig mit aufrechtem Kopf in das Halogenkohlenwasserstofföl um. Legen Sie dann ein Deckglas über den Objektträger und drücken Sie es vorsichtig nach unten, bis es die Larve berührt. Schieben Sie dann das Deckglas mit sanfter Kraft hinein, um die abzutragenden Zellen an die Stelle zu rollen, an der der Zwei-Photonen-Laser sie am leichtesten trifft. Die Position variiert je nachdem, welche Neuronen angegriffen werden.

Befestigen Sie nun die Montage auf dem Zwei-Photonen-Mikroskoptisch und fokussieren Sie sich mit einem 40-fachen Öl-Immersionsobjektiv auf die gewünschten Zellen. Wechseln Sie in der Software in den Scan-Modus und laden Sie das gespeicherte Protokoll. Achte darauf, dass die Lochblende ganz geöffnet ist. Im Live-Modus erhalten Sie dann ein gutes Bild des interessierenden Bereichs. Stoppen Sie anschließend den Live-Scan, sodass die Schaltfläche Zuschneiden verfügbar wird. Passen Sie mit der Funktion "Zuschneiden" das Scanfenster so an, dass der Zielbereich nur auf die potenzielle Verletzungsstelle fokussiert wird.

Öffnen Sie dann ein neues Imaging-Fenster. Reduzieren Sie nun die Scangeschwindigkeit und erhöhen Sie die Laserintensität. Schalten Sie dann die Endlostaste um, um den Scan zu starten und zu stoppen. Beobachten Sie genau. Sobald die Fluoreszenz drastisch ansteigt, beenden Sie den Scan. Wechseln Sie als Nächstes zurück zum ursprünglichen Bildfenster, wählen Sie den Live-Modus aus und suchen Sie den Bereich, auf den Sie gerade abzielen konnten, indem Sie den Fokus angepasst haben.

Ein guter Hinweis auf eine erfolgreiche Verletzung ist das Auftreten eines kleinen Kraters, einer ringförmigen Struktur oder lokalisierter Trümmer direkt an der Verletzungsstelle. Wäre die Laserleistung zu hoch, wäre ein großer Schadensbereich sichtbar, der tödlich sein kann.