JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Neurowissenschaften
0 Aufrufe • 2:19 Min. • July 8th, 2025
Beginnen Sie mit einer adhärenten Kultur reifer menschlicher Neuronen in einer matrixbeschichteten Platte.
Fügen Sie lentivirale Vektoren hinzu, die für ein mutiertes humanes Tau-Protein kodieren, das mit einem Reporter für gelb fluoreszierendes Protein (YFP) fusioniert ist.
Das Lentivirus bindet an spezifische neuronale Zelloberflächenrezeptoren und ermöglicht so die Fusion der Virus-Wirt-Membran und die Freisetzung von viraler RNA und Enzymen.
Die virale RNA wird in DNA reverse-transkribiert.
Die virale Integrase transportiert die DNA in den Zellkern, erleichtert die Integration in das Wirtsgenom und führt zur Produktion des YFP-markierten mutierten Tau-Proteins.
Im Laufe der Zeit bildet die mutierte Tau in den transduzierten Zellen zytoplasmatische Aggregate.
Waschen Sie die Zellen mit frischen Medien, um nicht internalisierte Viruspartikel zu entfernen.
Setzen Sie die Inkubation mit regelmäßigen Medienwechseln fort, um die neuronale Lebensfähigkeit zu erhalten und die Proteinaggregation zu fördern.
Visualisieren Sie die Neuronen unter einem Mikroskop.
Erfolgreich transduzierte Neuronen weisen zytoplasmatische Aggregate aus fluoreszierendem YFP-markiertem mutiertem Tau-Protein auf.
Um Neuronen mit Lentiviren zu transduzieren, verwenden Sie eine Titerzahl von 340.000 transduzierbaren Einheiten pro Zelle. Verdünnen Sie die übertragbaren Einheiten in Zellkulturmedien auf die erforderliche Konzentration und geben Sie sie zu den Zellen.
Waschen Sie die Zellen zwei Tage nach der Zugabe des Lentivirus einmal mit frischem Medium, das kein bFGF enthält.
Kultivieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid in Medien ohne bFGF weiter. Bewahren Sie die Zellen nach der Transduktion etwa acht Wochen lang auf und achten Sie darauf, die Zellkulturmedien jeden zweiten Tag zu wechseln. Verwenden Sie ein Lichtmikroskop, um die Zellen routinemäßig sichtbar zu machen und die Lebensfähigkeit sicherzustellen.