Why measure mitochondrial respiratory chain subunits for target validation?

Quantifying mitochondrial respiratory chain complex subunits enables assessment of target engagement effects on neuronal energy metabolism, supporting mechanistic de-risking in neurodegenerative disease programs.

How does isolating mitochondrial protein expression as an independent variable support discovery pipelines?

Isolating mitochondrial protein expression allows researchers to link specific targets or compounds to changes in energy metabolism, clarifying biological function in early discovery.

What do quantitative measurements of mitochondrial DNA levels enable in neuronal studies?

Quantitative mitochondrial DNA measurements provide a proxy for mitochondrial content and biogenesis, enabling normalization of functional readouts and assessment of organelle density.

Why are replication requirements important for cross-functional collaboration in mitochondrial profiling?

Replication ensures consistent, reproducible quantification of mitochondrial parameters across teams and sites, supporting reliable data transfer in target validation and assay development.

What statistical analysis capabilities are required before implementing this flow cytometry method?

Implementation requires the ability to analyze mean fluorescence intensity, calculate coefficients of variation, and apply statistical tests to compare mitochondrial protein expression across experimental conditions.

Messung mehrerer mitochondrialer Parameter in Neuronen mittels Durchflusszytometrie

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroscience

0 views • 2:09 min • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nehmen Sie fixierte und permeabilisierte Neuronen in einer Röhre.

Fügen Sie einen Blockierungspuffer hinzu, um eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern.

Die Suspension zentrifugieren und den Überstand entfernen. Suspendieren Sie dann die Neuronen im Puffer.

Die Suspension gleichmäßig in Röhrchen mit unmarkierten und fluorophormarkierten Primärantikörpern überführen.

Inkubieren, so dass die Antikörper spezifisch an die Untereinheiten der mitochondrialen Atmungskette oder des MRC-Komplexes, ein mitochondriales DNA-assoziiertes Protein und ein mitochondriales äußeres Membranprotein in den Neuronen binden können.

Entfernen Sie alle ungebundenen Antikörper.

Inkubieren Sie mit Fluorophor-markierten Sekundärantikörpern, die an die nicht markierten Primärantikörper binden.

Die Mischung zentrifugieren und den Überstand verwerfen.

Resuspendieren Sie die Neuronen in Puffer und übertragen Sie sie in Mikrozentrifugenröhrchen.

Durchführung einer Durchflusszytometrie zum Nachweis der Fluoreszenzsignale auf den markierten Neuronen, die den Expressionsniveaus der MRC-Komplexuntereinheiten und der Messung der relativen mitochondrialen DNA-Spiegel entsprechen.

Blockieren Sie die Proben in 1 Milliliter Blockpuffer und waschen Sie die Zellen durch Zentrifugation mit PBS, wie gezeigt. Um verschiedene mitochondriale Komplexe und Untereinheiten nachzuweisen, inkubieren die Zellen für 30 Minuten mit den jeweiligen Primärantikörpern, die im Textmanuskript beschrieben sind. Nachdem Sie die Zellen einmal mit PBS gewaschen haben, inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang mit Sekundärantikörpern.

Am Ende der Inkubation waschen und resuspendieren Sie die Zellen in PBS, wie gezeigt. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das im Dunkeln auf Eis aufbewahrt wird. Analysieren Sie als Nächstes die Zellen auf dem Durchflusszytometer, erkennen Sie Signale und filtern Sie eines mit einem 530/30-Bandpassfilter.