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Neurowissenschaften
0 Aufrufe • 2:59 Min. • July 8th, 2025
Beginnen Sie mit genetisch veränderten menschlichen Zellen in einem Wachstumsmedium.
Diese Zellen enthalten ein Tetracyclin-induzierbares System, das das Amyloid-Vorläuferprotein oder APP-Gen und ein Luciferase-Gen besitzt.
Austausch mit einem Medium, das Tetracyclin enthält, und Inkubation.
Tetracyclin bindet an das Aktivatorprotein, das wiederum an den APP-Promotor bindet.
Dies induziert die Genexpression und produziert die Vorläuferproteine, die sich an der Zellmembran lokalisieren.
Das Enzym β-Sekretase spaltet APP und erzeugt ein Fragment, das an der Zellmembran befestigt bleibt.
Die γ-Sekretase spaltet dieses Fragment, produziert Amyloid-β-Peptide und setzt eine Aktivatorkomponente frei.
Dieser Aktivator dringt in den Zellkern ein, bindet an den Luciferase-Promotor, induziert die Genexpression und produziert Luciferase-Enzyme.
Ersetzen Sie das Medium durch ein Assay-Reagenz, das das Luciferase-Substrat enthält. Das Substrat diffundiert in die Zellen und reagiert mit Luciferase, wodurch Biolumineszenz entsteht.
Verwenden Sie ein Mikroplatten-Reader, um die Lichtintensität zu messen, die direkt die γ-Sekretase-Aktivität widerspiegelt, ein Enzym, das bei neuropathologischen Zuständen von entscheidender Bedeutung ist.
Zählen Sie NG- oder CG-Zellen mit einem Hämozytometer. Anschließend säen Sie die Zellen mit 20.000 Zellen pro Vertiefung auf 96-Well-Mikroplatten mit einem Endvolumen von 200 Mikrolitern pro Vertiefung in Wachstumsmedium aus. Bringen Sie die Mikrotiterplatten in einen befeuchteten Kohlendioxid-Inkubator und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie nach der Inkubation über Nacht 100 Mikroliter Wachstumsmedium aus jeder Vertiefung.
Fügen Sie 100 Mikroliter pro Vertiefung Wachstumsmedium hinzu, das 2 Mikrogramm pro Milliliter Tetracyclin enthält, entweder mit 0,2 % Dimethylsulfoxid, zwei mikromolaren CL 387, 785, zwei mikromolaren DAPT oder anderen verwandten ErbB1/ErbB2-Inhibitoren. Inkubieren Sie die behandelten Zellen in Mikrotiterplatten bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden. Entfernen Sie nach der Inkubation 150 Mikroliter Wachstumsmedium pro Vertiefung aus den Mikrotiterplatten.
Fügen Sie dann 50 Mikroliter Luciferase-Assay-Reagenz pro Vertiefung hinzu. Übertragen Sie anschließend die Mikroplatten in einen Lumineszenz-Mikroplatten-Reader und halten Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Bestimmen Sie die von Glühwürmchen emittierte Luziferase mit einem vordefinierten Programm, das im Lumineszenz-Mikroplatten-Reader gespeichert ist.