Luciferase-Assay zur Messung der γ-Sekretase-Aktivität in menschlichen Zellen

Beginnen Sie mit genetisch veränderten menschlichen Zellen in einem Wachstumsmedium.

Diese Zellen enthalten ein Tetracyclin-induzierbares System, das das Amyloid-Vorläuferprotein oder APP-Gen und ein Luciferase-Gen besitzt.

Austausch mit einem Medium, das Tetracyclin enthält, und Inkubation.

Tetracyclin bindet an das Aktivatorprotein, das wiederum an den APP-Promotor bindet.

Dies induziert die Genexpression und produziert die Vorläuferproteine, die sich an der Zellmembran lokalisieren.

Das Enzym β-Sekretase spaltet APP und erzeugt ein Fragment, das an der Zellmembran befestigt bleibt.

Die γ-Sekretase spaltet dieses Fragment, produziert Amyloid-β-Peptide und setzt eine Aktivatorkomponente frei.

Dieser Aktivator dringt in den Zellkern ein, bindet an den Luciferase-Promotor, induziert die Genexpression und produziert Luciferase-Enzyme.

Ersetzen Sie das Medium durch ein Assay-Reagenz, das das Luciferase-Substrat enthält. Das Substrat diffundiert in die Zellen und reagiert mit Luciferase, wodurch Biolumineszenz entsteht.

Verwenden Sie ein Mikroplatten-Reader, um die Lichtintensität zu messen, die direkt die γ-Sekretase-Aktivität widerspiegelt, ein Enzym, das bei neuropathologischen Zust