JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Neurowissenschaften
0 Aufrufe • 3:14 Min. • July 8th, 2025
Die Regionen des Locus coeruleus, die sich bilateral im Hirnstamm der Maus befinden, enthalten Noradrenalin-produzierende Neuronen und regulieren verschiedene Regionen im Gehirn.
Um diese Locus coeruleus-Regionen zu erkennen, beginnen Sie mit einem Objektträger mit den festen, kryokonservierten Hirnstammschnitten der Maus.
Waschen Sie den Objektträger mit einem Puffer, um Fixierspuren zu entfernen.
Fügen Sie einen Puffer mit Reinigungsmittel hinzu und inkubieren Sie, um die Membranen zu permeabilisieren, und waschen Sie sie dann.
Einführung von Primärantikörpern, die spezifisch für das Enzym Dopamin β-Hydroxylase sind, das Dopamin in Noradrenalin, einen Neurotransmitter, umwandelt.
Inkubieren, damit die Antikörper mit Dopamin β-Hydroxylase interagieren können.
Waschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen.
Fügen Sie dann grüne Fluorophor-gekoppelte Sekundärantikörper hinzu und inkubieren Sie im Dunkeln.
Die Sekundärantikörper binden an die Primärantikörper und waschen sich dann.
Geben Sie Einbettmittel auf die Gehirnabschnitte, decken Sie sie ab und trocknen Sie sie.
Betrachten Sie die Objektträger unter einem Fluoreszenzmikroskop.
Die grüne Fluoreszenz, die die markierten Noradrenalin-produzierenden Neuronen in den Hirnschnitten darstellt, deutet auf das Vorhandensein von Locus coeruleus-Regionen hin.
Waschen Sie am ersten Tag die Gehirnscheiben in der 24-Well-Platte 3 Mal für jeweils 5 Minuten in PBS. Fügen Sie dann 0,5 % PBS mit dem Waschmittel hinzu und permeabilisieren Sie sie 24 Stunden lang bei 4 Grad Celsius.
Am Folgetag die Scheiben dreimal für je 5 Minuten mit 0,5% PBSD waschen. Dann wird der Primärantikörper in einer Verdünnung von 1 bis 500 in 0,5 % PBSD zugegeben und 18 Stunden lang bei 4 Grad Celsius inkubiert.
Am 3. Tag die Scheiben 3 Mal für je 10 Minuten mit 0,5% PBSD waschen. Fügen Sie dann den Sekundärantikörper in einer Verdünnung von 1 bis 1.000 in 0,5 % PBSD hinzu. Wickeln Sie die Platte mit Alufolie ein und inkubieren Sie sie 16 Stunden lang bei 4 Grad Celsius.
Waschen Sie die Scheiben nach der Inkubation 3 Mal für jeweils 5 Minuten mit 0,5 % PBSD und dann 5 Minuten lang in PBS. Decken Sie die Abschnitte mit fest abgebundenem Einbettmedium ohne DAPI ab. Mit einer Glasabdeckung abdecken und 30 Minuten bei Raumtemperatur trocknen lassen. Verwenden Sie dann ein konfokales Mikroskop mit Einstellungen zur Erkennung des Signals von der geeigneten Fluoreszenzwellenlänge, um Gehirnschnitte abzubilden.