Untersuchung der Lymphozytentransmigration durch eine mikrovaskuläre Endothelzell-Monoschicht

Nehmen Sie eine Mikroplatte mit Transwell-Einsätzen, die mit EZM-Proteinen beschichtet sind, um die Zelladhäsion zu fördern.

Mikrovaskuläre Endothelzellen (HBMECs) des menschlichen Gehirns werden in die Einsätze und ein Wachstumsmedium in die unteren Kompartimente gegeben.

Inkubieren, damit die Zellen anhaften und zu einer Monoschicht heranwachsen können. Diese Zellen exprimieren Tight Junctions, die das Endothel der Blut-Hirn-Schranke nachahmen, das den Durchgang von Zellen und Molekülen einschränkt.

Entfernen Sie das Medium. Geben Sie periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) in die Einsätze und ein Kulturmedium in die unteren Kompartimente.

Inkubieren, wodurch PBMC-Lymphozyten mit den Endothelzellen interagieren und dann zwischen ihnen hin- und herwandern können, ein Prozess, der als Transmigration bezeichnet wird.

Spülen Sie den Einsatzboden aus und sammeln Sie die anhaftenden transmigrierten Zellen in den unteren Kammern.

Einführung fluoreszierender Mikrokügelchen als Referenz für die Zellquantifizierung.

Übertragen Sie die Suspension in ein Röhrchen, zentrifugieren Sie, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie sie in einem Fluorophor-konjugierten Antikörpercocktail, um die Lymphozyten zu markieren.

Die transmigrierten Lymphozyten sind bereit für die Quantifizierung mittels Durchflusszytometrie.

Um die Zellkultureinsätze für einen Transmigrationsassay vorzubereiten, fügen Sie zunächst 100 Mikroliter Fibronektinlösung zu jedem Einsatz und zu einer Vertiefung einer 96-Well-Platte mit flachem Boden hinzu. Ersetzen Sie nach drei Stunden bei 37 Grad Celsius die Fibronektinlösung durch 100 Mikroliter HBMEC und geben Sie 600 Mikroliter frisches ECM-b-Medium in die unteren Kompartimente der Zellkultureinsätze.

Stellen Sie die Platten dann für drei bis vier Tage wieder in den Zellkultur-Inkubator. Resuspendieren Sie die mononukleäre Blutzelle oder PBMC-Probe auf eine 5 mal 10 bis 6 Zellen pro Milliliter Konzentration in RPMI-Medium, das mit B27 ergänzt ist. Als nächstes aspirieren Sie das Medium aus den unteren und oberen Kompartimenten der entsprechenden Anzahl von Zellkultureinsätzen, die die konfluenten HBMEC-Monoschichten enthalten, und fügen Sie 100 Mikroliter PBMC pro Spender zu den Zellkultureinsätzen und zu einer Vertiefung einer 24-Well-Platte pro In-vitro-Kontrolle hinzu.

Geben Sie 600 Mikroliter RPMI plus B27 in die unteren Kammern der Zellkultureinsätze und 500 Mikroliter in die In-vitro-Kontrollvertiefungen und stellen Sie die Platten für sechs Stunden wieder in den Zellkultur-Inkubator. Entfernen Sie am Ende der Inkubation die Zellkultureinsätze mit einer Pinzette und spülen Sie den Boden vorsichtig mit 400 Mikrolitern PBS ab, ohne die Membranen zu berühren.

Mischen Sie dann gründlich 20 Mikroliter Flow-Count-Fluorosphären mit den Zellen in den experimentellen und in vitro-Kontrollwells und überführen Sie 1 Milliliter der resultierenden PBMC-Suspensionen in die entsprechenden Durchflusszytometrie-Röhrchen. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und fügen Sie jeder Probe die interessierenden Fluorochrom-konjugierten Antikörper in 100 Mikrolitern Durchflusszytometrie-Puffer hinzu. Waschen Sie die Zellen nach 30 Minuten bei 4 Grad Celsius mit 250 Mikrolitern frischem Durchflusszytometrie-Puffer und resuspendieren Sie die Pellets in das entsprechende Volumen des Durchflusszytometrie-Puffers für die Analyse.