Bewertung des transendothelialen elektrischen Widerstands in einem in vitro Blut-Hirn-Schrankenmodell

Beginnen Sie mit einem Membraneinsatz, der mikrovaskuläre Endothelzellen des Mausgehirns enthält, die einer In-vitro-Blut-Hirn-Schranke ähneln.

Platzieren Sie diesen Einsatz in einer transendothelialen elektrischen Widerstands- oder TEER-Instrumentenvertiefung, die eine eingebettete Elektrode enthält.

Legen Sie frisches Medium in das untere Fach.

Setzen Sie den Deckel mit den Elektroden über die TEER-Vertiefungen, legen Sie das Instrument dann in einen Inkubator und schließen Sie es an ein Aufnahmesystem an.

Die Elektroden erzeugen einen elektrischen Strom über die Zellschicht zur Messung des transendothelialen Widerstands.

Intakte Verbindungsproteine zwischen den Zellen behindern den Stromfluss, was zu einem höheren TEER-Wert führt.

Trennen Sie das Instrument und entfernen Sie es.

Demontieren Sie den Deckel, entfernen Sie etwas Medium aus dem oberen Fach und fügen Sie voraktivierte T-Zellen hinzu. Bauen Sie das Gerät für die TEER-Messung wieder zusammen.

Aktivierte T-Zellen interagieren mit den Endothelzellen, setzen Entzündungsfaktoren und zytolytische Enzyme frei und stören die Integrität der Verbindung.

Diese Störung erhöht den elektrischen Stromfluss, was zu einem niedrigeren TEER-Wert führt.

Um die TEER-Messung einzurichten, platzieren Sie das 24-Well-Modul des TEER-Instruments in der Laminar-Flow-Haube. Entfernen Sie die Deckel und setzen Sie die Einsätze mit MBMECs mit einer Pinzette in das Instrument ein.

Pipettieren Sie anschließend 810 Mikroliter des frischen Mediums in das untere Fach der Modulvertiefungen. Legen Sie es vorsichtig zwischen den Einsatz und die Wand des Moduls. Schließen Sie danach die Deckel und legen Sie das Instrument in den Inkubator. Schließen Sie das Gerät an den Computer an. Schalten Sie dann den Gerätecontroller ein und öffnen Sie die Software.

Wählen Sie im Popup-Fenster "Neue Messung" aus. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen "TEER anzeigen" und "Ccl anzeigen" und drücken Sie dann auf "Start". Wählen Sie nach Abschluss der ersten Messung auf der Registerkarte "Ergebnisse" die Option "Alle Wells überprüfen", um alle TEER- und Ccl-Werte anzuzeigen. Speichern Sie dann die Datei.

Wählen Sie als Nächstes den Zeitpunkt für die Co-Kultivierung von MBMECs mit T-Zellen, wenn Ccl stabil und niedriger als 1 Mikrofarad pro Quadratzentimeter ist und TEER seinen Höchstwert erreicht hat. Überprüfen Sie sorgfältig die absoluten TEER- und Ccl-Werte, und schließen Sie die Vertiefungen aus, in denen MBMECs keine ausreichend konfluenten Monoschichten entwickelt haben, indem Sie diese Vertiefungen deaktivieren.

Gruppieren Sie die restlichen Vertiefungen, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Vertiefungen klicken und "Bohrloch zum neuen durchschnittlichen Bohrloch hinzufügen" auswählen. Benennen Sie es im Popup-Fenster und machen Sie dasselbe für alle einzelnen Wells, die gruppiert werden sollen. Überprüfen Sie dann alle durchschnittlichen Vertiefungen, um sicherzustellen, dass alle die gleichen Anfangsbedingungen vor der Co-Kultur haben.

Drücken Sie auf der Registerkarte "Experiment" auf "Pause". Trennen Sie das Gerät und nehmen Sie es aus dem Inkubator. Entfernen Sie dann die Deckel in der Laminar-Flow-Haube. Entfernen Sie anschließend einen Teil des Mediums aus dem Einsatz im oberen Vertiefungsfach. Fügen Sie T-Zellen zu MBMECs hinzu, indem Sie vorsichtig 150 Mikroliter Medium pipettieren. Schließen Sie dann das Gerät wieder an und drücken Sie auf "Messung fortsetzen". Drücken Sie nach 24 Stunden auf der Registerkarte "Experiment" auf "Stopp" und speichern Sie die Datei.