JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowissenschaften
0 Ansichten • 2:58 Min. • July 8th, 2025
Nehmen Sie einen fixierten Schnitt aus dem Gehirn einer Maus, der den Nucleus basalis von Meynert enthält, der reich an Nervenfasern ist, die das Enzym Cholinacetyltransferase exprimieren.
Der Abschnitt wird vorbehandelt, um die endogene Peroxidase zu deaktivieren.
Fügen Sie ein Detergens hinzu, um die Zellmembranen zu permeabilisieren, gefolgt von einer Blockierungslösung, um eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern.
Ersetzen Sie die Lösung durch Primärantikörper, die an Cholinacetyltransferase binden.
Mit Puffer waschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen. Inkubieren Sie mit Biotin-markierten Sekundärantikörpern, die an die Primärantikörper binden.
Entfernen Sie ungebundene Antikörper und fügen Sie Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplexe hinzu, die an die Sekundärantikörper binden.
Waschen, um überschüssige Komplexe zu entfernen.
Fügen Sie ein chromogenes Substrat hinzu, das mit Peroxidase reagiert und einen farbigen Niederschlag bildet.
Mit destilliertem Wasser abspülen, um überschüssigen Niederschlag zu entfernen.
Übertragen Sie den Schnitt auf einen gelatinierten Objektträger.
Als nächstes dehydrieren Sie den Abschnitt mit steigenden Ethanolkonzentrationen, gefolgt von Xylol.
Montieren Sie den Schnitt und beobachten Sie ihn unter einem Mikroskop, um die gefärbten Nervenfasern sichtbar zu machen.
Für die immunhistochemische Markierung der Gewebeschnitte werden nach Blockierung einer unspezifischen Bindung mit 10 % normalem Rinderserum in 0,1 % Triton X-100 in Tris-gepufferter Kochsalzlösung die Schnitte 48 Stunden lang bei vier Grad Celsius mit dem primären Antikörper von Interesse markiert.
Waschen Sie die Abschnitte am Ende der Inkubation dreimal drei Minuten lang in frischer, mit Tris-Puffer gepufferter Kochsalzlösung pro Waschgang. Gefolgt von einer einstündigen Inkubation mit einem geeigneten biotinylierten Sekundärantikörper bei Raumtemperatur.
Waschen Sie die Schnitte am Ende der Inkubation dreimal in frischer, mit Tris-Puffer gepufferter Kochsalzlösung, wie gezeigt. Gefolgt von der Färbung mit dem Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex und der DAB-Peroxidase-Substratlösung gemäß den Protokollen des Herstellers.
Montieren Sie nach dem Waschen alle Schnitte einer Hirngewebeprobe auf einen gelatinierten Objektträger. Lassen Sie die Proben an der Luft trocknen. Um die Schnitte zu dehydrieren, tauchen Sie die Proben zweimal, fünf Minuten lang, pro Verdünnung in aufeinanderfolgende aufsteigende Ethanollösungen, wie angegeben, gefolgt von einer Reinigung mit zwei 10-minütigen Xylol-Waschgängen. Verwenden Sie dann ein geeignetes Montagemedium, um Deckgläser auf die Dias zu kleben.