Fluoreszenzfärbung von Neuralleistenzellen, die auf Hydrogelen unterschiedlicher Steifigkeit kultiviert wurden

Nehmen wir adhärente Neuralleisten-Zellkulturen, die auf Deckgläsern gezüchtet wurden, die mit Hydrogelen unterschiedlicher Steifigkeit beschichtet waren. Waschen Sie die Zellen mit Puffer.

Fügen Sie Paraformaldehyd hinzu, um die Zellen zu fixieren und die Zellmorphologie zu erhalten.

Waschen Sie die Zellen mit Puffer, um überschüssiges Paraformaldehyd zu entfernen.

Fügen Sie als Nächstes ein nichtionisches Detergens hinzu, um die Zellmembranen zu permeabilisieren.

Waschen Sie die Zellen mit Puffer, um überschüssiges Reinigungsmittel zu entfernen.

Führen Sie dann eine Blockierungslösung ein, um unspezifische Bindungen zu verhindern.

Inkubieren Sie die Zellen mit einer hochaffinen filamentösen Aktinsonde, die an Aktinfilamente bindet.

Waschen Sie die Zellen mit Puffer, um ungebundene Sonden zu entfernen.

Fügen Sie einen fluoreszierenden Kernfarbstoff hinzu, um die Kerne zu färben, und waschen Sie ihn dann mit Puffer, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen.

Tragen Sie Eindeckmittel auf die Deckgläser auf und untersuchen Sie die gefärbten Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop.

Zellen, die

auf steiferen Hydrogelen gezüchtet wurden, zeigen eine erhöhte Aktinfilamentbildung und eine breitere Morphologie als solche, die auf weicheren Hydrogelen gezüchtet wurden.

Transportieren Sie die Deckgläser mit einer Pinzette auf eine neue Platte, um falsche Signale von den direkt auf die Platte gezüchteten Zellen zu minimieren. Fixieren Sie dann die Zellen 10 Minuten lang mit 500 Mikrolitern 4 % Paraformaldehyd, bevor Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern 0,1 % Triton X-100 bei Raumtemperatur behandeln.

Nach 15 Minuten blockieren Sie die Zellen mit 250 Mikrolitern 10% Eselserum. Färben Sie die Zellen auf F-Aktin mit Phalloidin in einer Verdünnung von 1 bis 400 in 250 Mikrolitern 10% Eselserum, gefolgt von einer 10-minütigen Inkubation mit DAPI

.

Waschen Sie die Zellen zwei Minuten lang mit PBS, bevor Sie drei bis vier Tropfen Eindeckmittel in jede Vertiefung geben. Nehmen Sie an einem Fluoreszenzmikroskop die Bilder von mindestens drei zufälligen Bildern pro Hydrogelprobe auf, die einzelne und verschmolzene Kanäle erzeugen.