Immunfärbung von fluoreszenzmarkierten Astrozyten in einem Schnitt aus einem Gewebeschnitt aus dem Gehirn einer Maus

Nehmen Sie einen fixierten Gewebeschnitt aus dem Gehirn einer Maus, der eine spärliche Population von Astrozyten enthält, die ein fluoreszierendes Protein exprimieren.

Behandeln Sie den frei schwebenden Abschnitt mit einem detergenzienhaltigen Puffer, um die Zellen zu permeabilisieren.

Inkubieren Sie den Abschnitt in einem Blockierungspuffer, um eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern.

Behandeln Sie den Abschnitt mit Primärantikörpern und inkubieren Sie, damit die Antikörper an die fluoreszierenden Proteine in den Astrozyten binden können.

Überschüssige Primärantikörper werden mit Puffer abgewaschen.

Inkubieren Sie anschließend den Abschnitt mit Fluorophor-markierten Sekundärantikörpern, die an die Primärantikörper binden.

Ungebundene Sekundärantikörper mit einem Puffer abwaschen.

Übertragen Sie den Abschnitt in ein Puffer-deionisiertes Wassergemisch, um Waschmittelrückstände zu entfernen.

Legen Sie den Abschnitt auf einen Objektträger mit pufferdeionisiertem Wasser. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit und fügen Sie Einbettmedien hinzu. Positionieren Sie dann ein Deckglas und befestigen Sie es.

Verwenden Sie abschließend die konfokale Mikroskopie, um die markierten fluoreszierenden Protein-exprimierenden Astrozyten innerhalb des Schnitts zu visualisieren.

Bereiten Sie zunächst eine frische TBST-Lösung vor, indem Sie 1 Milliliter 10 % Triton X in ein 50-Milliliter-Röhrchen geben und das Röhrchen auf 50 Milliliter mit TBS füllen. Bereiten Sie 2 Milliliter Blockierungs- und Antikörperlösungen für jedes Gehirn vor, indem Sie Ziegenserum und TBST in einem 15-Milliliter-Röhrchen kombinieren.

Beschriften Sie als Nächstes eine 24-Well-Platte, um verschiedene Proben in verschiedenen Reihen, in verschiedenen Lösungen und in verschiedenen Spalten zu platzieren. Fügen Sie dann 1 Milliliter TBST zu den ersten drei Spalten hinzu, die als "Waschen 1", "Waschen 2" und "Waschen 3" beschriftet sind, und fügen Sie 1 Milliliter Blockierungslösung in die vierte Spalte hinzu.

Bereiten Sie ein Glasplektrum vor, indem Sie das Ende einer 5,75-Zoll-Pasteur-Pipette mit einem Bunsenbrenner zu einem kleinen Haken schmelzen. Übertragen Sie dann Gewebeschnitte aus der 12-Well-Platte mit dem Plektrum in die Spalte "Wash 1" der 24-Well-Platte. Waschen Sie dann die Abschnitte jeweils 10 Minuten lang in den Vertiefungen 1, 2 und 3, indem Sie die Abschnitte mit dem Glaspickel von einer Vertiefung in die nächste übertragen, und inkubieren Sie die Abschnitte anschließend eine Stunde lang in der Blocklösung.

Als nächstes inkubieren Sie die Abschnitte im Primärantikörper für zwei bis drei Nächte bei 4 Grad Celsius unter Schütteln. Nach der Inkubation des primären Antikörpers aspirieren Sie das TBST am ersten Tag aus den Waschvertiefungen. Geben Sie dann 1 Milliliter neues TBST in jede Waschmulde und schieben Sie die Abschnitte in die erste Waschwanne.

Inkubieren Sie anschließend die Abschnitte drei Stunden lang bei Raumtemperatur in Sekundärantikörpern. Nach der Inkubation der sekundären Antikörper wird das TBST vom zweiten Tag aus den Waschvertiefungen aspiriert. Geben Sie dann 1 Milliliter neues TBST in jede Waschwanne und schieben Sie die Abschnitte in die erste Waschwanne.

Nehmen Sie bei der letzten Wäsche das Eindeckmedium aus 4 Grad Celsius heraus und lassen Sie es auf Raumtemperatur erwärmen. Bereiten Sie dann eine 2 zu 1 Mischung TBS in entionisiertem Wasser zu und geben Sie sie in eine Petrischale. Bereiten Sie als Nächstes einen Objektträger vor, indem Sie 800 Mikroliter 2 bis 1 Mischung TBS in deionisiertem Wasser auf die Oberfläche geben.

Übertragen Sie die Abschnitte aus der Wash 3 Vertiefung in die Petrischale. Übertragen Sie dann mit einem feinen Pinsel die Abschnitte nacheinander aus der Petrischale in die Flüssigkeit auf dem Objektträger. Ordnen Sie anschließend die Abschnitte mit dem Pinsel vorsichtig so an, dass sie flach auf der Folie liegen. Entfernen Sie vorsichtig überschüssige Flüssigkeit mit einer P1000-Pipette aus dem Objektträger, gefolgt von einer Vakuumaspiration.

Sobald die überschüssige Flüssigkeit von der Folie entfernt wurde, verwenden Sie eine Transferpipette, um sofort einen Tropfen Eindeckmedium auf jeden Abschnitt zu geben und legen Sie vorsichtig ein Deckglas über die Folie. Lassen Sie das Eindeckmedium einige Minuten lang ausbreiten, und entfernen Sie dann überschüssige Einbettmedien, die unter dem Deckglas hervortreten, durch Vakuumaspiration. Versiegeln Sie anschließend alle vier Kanten des Deckglases mit klarem Nagellack.