Laser-Capture-Mikrodissektion zur Isolierung von Purkinje-Zellen aus einem menschlichen postmortalen Kleinhirngewebe

Nehmen wir ein menschliches postmortales Kleinhirngewebe, das die Purkinje-Zell-, Körner- und Molekülzellschichten enthält.

Legen Sie es auf einen Kryostat-Probenhalter, der teilweise gefrorene Einbettmedien enthält.

Lassen Sie das Medium vollständig einfrieren und sichern Sie das Gewebe.

Übertragen Sie diese Baugruppe in den Kryostat-Schneidarm und lassen Sie das Gewebe sich an die Kryostatentemperatur akklimatisieren.

Bewegen Sie das Gewebe näher an die Klinge und schneiden Sie es ab, um die Kortexschichten freizulegen.

Platzieren Sie eine Abrollschutzplatte über der Klinge und erhalten Sie Kleinhirnabschnitte.

Übertragen Sie diese Abschnitte auf einen Membranschieber.

Inkubieren Sie in steigenden Ethanolkonzentrationen zur Gewebefixierung und Dehydratisierung.

Dann in Xylol inkubieren.

Trocknen Sie den Objektträger und legen Sie ihn auf einen UV-Laser-Capture-Mikroskoptisch.

Positionieren Sie die Entnahmekappe über dem Kleinhirngewebe.

Konzentrieren Sie sich mikroskopisch auf die Purkinje-Zellen.

Erfassen und sammeln Sie mit dem Laser die Purkinje-Zellen für die weitere Analyse.

Schneiden Sie zunächst ein kleines Stück Gewebe für den Schnitt ab und stellen Sie sicher, dass der Schnitt zu etwa 95 % aus Kleinhirnrinde besteht. Legen Sie das restliche Taschentuch entweder auf Trockeneis oder in einen Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius. Beginnen Sie als Nächstes, langsam mit kreisenden Bewegungen OCT auf das Spannfutter zu geben. Bauen Sie Schichten aus OCT auf, bis ein etwa drei Millimeter hoher Hügel das Futter bedeckt.

Wenn das OCT teilweise gefroren ist, aber noch etwas Flüssigkeit in der Mitte hat, legen Sie das Taschentuch auf den Hügel. Lassen Sie die Taschentücher 1 bis 2 Minuten auf dem OCT ruhen, bis es vollständig gefroren ist. Dann wird das Spannfutter mit dem gefrorenen OCT und dem Gewebe in den Kryostat-Schneidarm überführt. Stellen Sie das Taschentuch so ein, dass es bündig mit der Schneidklinge abschließt, und lassen Sie die Taschentücher 20 Minuten lang im Schneidarm sitzen, um sich an die neue Temperatur anzupassen.

Der wichtigste Schritt besteht darin, das Gewebe so lange wie nötig im Kryostat-Schneidarm akklimatisieren zu lassen. Wenn Gewebe zerfetzt wird, wird die Visualisierung der Purkinje-Zellen sehr schwierig. Ich empfehle, kleinere, dünnere Gewebestücke zu verwenden, damit sich das Gewebe schneller akklimatisieren kann.

Bewegen Sie danach das Gewebe langsam näher an die Klinge. Sobald das Gewebe die Klinge erreicht hat, beginnen Sie mit dem Trimmen. Trimmen Sie das Gewebe 2 bis 3 Mal, bis die Rindenschichten sichtbar sind.

Platzieren Sie als Nächstes die Abrollschutzplatte direkt über der Kryostatklinge und richten Sie sie aus. Schneiden Sie 4 bis 6 Abschnitte mit einer Dicke von 14 Mikrometern und beachten Sie, dass die richtig geschnittenen Abschnitte unter der Abrollschutzplatte flach sind. Richten Sie die Schnittabschnitte horizontal über den Kryostattisch aus.

Winkeln Sie einen Objektträger an, um alle Gewebeteile gleichzeitig aufzunehmen. Legen Sie den Objektträger unmittelbar nach dem Schnitt des Gewebes für 2 Minuten in einen Objektträgerhalter mit 70% Ethanol auf Eis. Übertragen Sie den Objektträger für 45 Sekunden auf einen Objektträger mit 95% Ethanol auf Eis.

Legen Sie anschließend den Objektträger in einen Objektträgerhalter mit 100% Ethanol bei Raumtemperatur für 2 Minuten. Tauchen Sie den Objektträger 3 Mal bei Raumtemperatur in den Objektträgerhalter, der Xylol Nummer 1 enthält. Legen Sie dann den Objektträger in einen Objektträgerhalter mit Xylol 2 bei Raumtemperatur für 5 Minuten. Stellen Sie die Rutschen in einen sauberen Abzug und lassen Sie sie mindestens 30 Minuten an der Luft trocknen.

Verwenden Sie zunächst RNase dekontaminiert, um den Mikroskoptisch im Kappenauffangarm zu reinigen. Legen Sie den Objektträger mit behandschuhten Händen auf das Mikroskop und eine undurchsichtige 500-Mikroliter-Kappe in den Auffangarm. Richten Sie die undurchsichtige Kappe bei geringer Vergrößerung über dem Kleinhirngewebe aus und stellen Sie sicher, dass die Kappe den gesamten Bereich abdeckt, der im Okular sichtbar ist.

Verwenden Sie ein 5- bis 10-faches Ziel, um die Kleinhirnschichten zu visualisieren. Platzieren Sie den Mauszeiger über dem Schnittpunkt, an dem sich die Molekülschicht und die Körnerzellschicht schneiden. Gehen Sie zu einer 40-fachen Vergrößerung über und visualisieren Sie die Purkinje-Zellen. Beginnen Sie dann mit der Aufnahme.