Steigende cDNA Erträge aus Einzel-Zell-Mengen von mRNA in Standard Laboratory Reverse-Transkriptase-Reaktionen mit Acoustic Microstreaming
11. Juli 2011
Wir beschreiben ein neuartiges Verfahren zur Erhöhung der cDNA-Ausbeute von Single-Cell-Mengen von mRNA in sonst üblichen Labor reverse Transkription Reaktionen. Die Neuheit besteht in der Verwendung von einem Mikromischer, die das Phänomen der akustischen Microstreaming nutzt, um Flüssigkeiten bei Mikroliter Skalen effektiver Mix als Schütteln, Vortexen oder Verreibung.
Dieses Verfahren erhöht die CD-NA-Ausbeuten aus Einzelzellmengen an mRNA. Beginnen Sie damit, den Mikromischer in einem Inkubator auf die gewünschte Temperatur für die Reverse-Transkriptionsreaktion einzustellen. Bereiten Sie anschließend Standard-RTP-Reaktionen im Labor maßstab vor, die Einzelzellmengen an RNA in Mikroliter-Volumina enthalten.
Stellen Sie das Reaktionsröhrchen sicher in die Mischlöcher ein, wählen Sie geeignete Mischparameter aus und schalten Sie den Mikromischer ein. Letztendlich kann dieses Verfahren verwendet werden, um erhöhte cDNA-Ausbeuten durch quantitative PCR als Vorbereitung für die RT-Reaktion zu erhalten. Temperieren Sie den Mikromischer mindestens eine Stunde lang in einem 37 °C warmen Inkubator.
In standardisierten sterilen nukleasefreien 200-Mikroliter-Dünnwand-PCR-Röhrchen. Richten Sie die Reverse-Transkriptase-Reaktionen gemäß den Anweisungen des Herstellers ein, verwenden Sie jedoch Mengen an Gesamt-RNA für einzelne Zellen als Input. Wählen Sie nun die geeignete Frequenz und Amplitude für die Mikromischung.
Als Nächstes den Probengefäß sicher in den Mikromischer einsetzen. Dann den Mikromischer einschalten. Die Reaktion 60 Minuten lang ablaufen lassen. Nach Ablauf der Zeit den Mikromischer ausschalten und die Ansätze sofort auf Eis überführen, um sie unverzüglich für nachfolgende Downstream-Anwendungen zu verwenden. Im Vergleich zu anderen Methoden liegt der Hauptvorteil des Mikromischens im Kontext von RT-Reaktionen in der DNA-Ausbeute.
Bei dieser quantitativen Polymerase-Kettenreaktionsanalyse veranschaulichen die QPCR-Kurven unter Verwendung von Primern, die zur Detektion von cDNA entwickelt wurden, die neuro-eine-mRNA darstellt, die Auswirkungen der Mikrom-Mischung für die ersten fünf Minuten oder der gesamten 60 Minuten im Vergleich zur Dauer der RT-Reaktion unmittelbar vor der RT-Inkubation. Das Mikrom-Mischen für die ersten fünf Minuten führte im Vergleich zu keiner signifikanten Verbesserung. Allerdings ergab das Mikrom-Mischen über die gesamten 60 Minuten eine signifikante Verbesserung der Ausbeute, die 15 QPCR-Zyklen entspricht.
Außerdem zeigt die Schmelzkurvenanalyse der QPCR, dass eine Mikrovermischung während der gesamten 60 Minuten der vorherigen R2-Reaktion ein konsistentes Signal in duplizierten Proben erzeugt, wie durch die roten Kurven dargestellt. Dies steht im Gegensatz zu den variablen Kurven, die bei einer Mikrovermischung nur für die ersten fünf Minuten, wie in blau dargestellt, oder bei alleiniger Inkubation, wie in schwarzen und grauen Kurven dargestellt, beobachtet werden. Die grauen Kurven stellen Kontrollen ohne Matrize dar.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt eine neuartige Methode zur Steigerung der cDNA-Ausbeute aus Einzelzell-mRNA unter Verwendung eines Mikromischers vor. Die Technik nutzt akustisches Mikroströmen, um die Flüssigkeitsmischung in standardmäßigen reversen Transkriptionsreaktionen zu verbessern.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Biotechnologie
- Genomik
Hintergrund
- Die cDNA-Synthese ist entscheidend für die Analyse der Genexpression.
- Die Einzelzellanalyse birgt Herausforderungen hinsichtlich der RNA-Ausbeute.
- Herkömmliche Mischmethoden können für kleine Volumina unzureichend sein.
- Die akustische Mikroströmung bietet eine mögliche Lösung für eine verbesserte Durchmischung.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Methode zur Erhöhung der cDNA-Ausbeute aus mRNA einzelner Zellen.
- Verwendung eines Mikromischers zur Verbesserung der Fluidmischung.
- Beurteilung der Wirksamkeit dieser Methode in Standard-RT-Reaktionen.
Verwendete Methoden
- Den Mikromischer in einem Inkubator bei 37 °C einschwingen lassen.
- Standardmäßige Reverse-Transkriptionsreaktionen mit Einzelzell-RNA aufsetzen.
- Reaktionsgefäße in den Mikromischer einsetzen.
- Mischparameter einstellen und den Mikromischer aktivieren.
Hauptergebnisse
- Es wurden höhere cDNA-Ausbeuten im Vergleich zu herkömmlichen Methoden beobachtet.
- Der Mikromischer verbesserte die Vermischung effektiv auf Mikroliter-Skala.
- Quantitative PCR-Ergebnisse bestätigten die verbesserten Ausbeuten.
- Die Methode ist für verschiedene Einzelzell-RNA-Analysen anwendbar.
Schlussfolgerungen
- Der Mikromischer bietet einen erheblichen Vorteil bei der cDNA-Synthese aus Einzelzell-mRNA.
- Dieser Ansatz kann genauere Genexpressionsstudien ermöglichen.
- Zukünftige Anwendungen könnten umfassendere Transkriptom-Analysen auf Einzelzellebene umfassen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Steigerung der cDNA-Ausbeute aus einzelnen Zellen des mRNA adressiert einen kritischen Engpass bei der Zielvalidierung und phänotypischen Bildschirmung. Indem sie die Analyse einer größeren Anzahl von Genen pro Zelle mit quantitativer Präzision ermöglicht, verbessert diese Methode das Vorhersagevertrauen bei frühen Entdeckungsentscheidungen. Der Ansatz trägt zur Entschärfung therapeutischer Hypothesen bei, indem er reproduzierbare, skalierbare molekulare Messgrößen aus begrenzten biologischen Proben liefert.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, indem die Anzahl nachweisbarer Genziele pro einzelner Zelle erhöht wird.
- Operationaler Wert: Verringert die technische Variabilität bei der Umwandlung von mRNA in cDNA und verbessert so die Konsistenz des Assays zwischen Wiederholungen.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Priorisierung von Portfolio-Kandidaten durch zuverlässigere Detektion seltener Transkripte, die mit Krankheitsmechanismen assoziiert sind.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erstellt validierte cDNA-Bibliotheken für die nachgeschaltete Screening-Analyse und erhöht dadurch die Empfindlichkeit bei der Identifizierung von Hits.
- Operativer Wert: Standardisiert die Verarbeitung der RNA-Eingabemenge unter Verwendung gängiger Laborgeräte und verbessert so den Durchsatz.
- Plattform-Wert: Kompatibel mit Standard-RT-Reagenzien und qPCR-Analytik, wodurch die Integration in bestehende Screening-Kaskaden erleichtert wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Biomarker-Entdeckung aus seltenen Zellpopulationen, indem die Nachweisgrenzen für transiente oder schwach exprimierte Zielstrukturen verbessert werden.
- Operationaler Wert: Liefert quantitative, reproduzierbare Ergebnisse, die die Zusammenarbeit zwischen Entdeckungs- und präklinischen Teams unterstützen.
- Risikominderung: Verringert das Risiko falsch-negativer Ergebnisse bei der Zielstruktur-Validierung, indem der cDNA-Ertrag erhöht wird, ohne dass eine spezialisierte Mikrofluidik-Infrastruktur erforderlich ist.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den frühen Entdeckungsprozess ein und unterstützt insbesondere den Übergang von der Generierung von Zielhypothesen zur Identifizierung von Leitstrukturen, indem sie die Qualität und Quantität molekularer Eingaben für funktionelle Screenings verbessert.
- Entdeckungsbiochemie: Verbessert die Zielvalidierung, indem eine umfassende transkriptionelle Profilierung aus Einzelzell-mengen an mRNA ermöglicht wird.
- Screening: Verbessert die Bereitschaft für Assays durch erhöhte cDNA-Ausbeute und unterstützt so den zuverlässigen Nachweis von durch Verbindungen induzierten Expressionsänderungen.
- Analytik: Erzeugt quantitative, mit qPCR kompatible Ergebnisse, die statistische Vergleiche der Genexpression unter verschiedenen experimentellen Bedingungen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Unterstützt den Übergang in die präklinische Forschung, indem der Nachweis krankheitsrelevanter Transkripte in begrenzten primären Zellproben ermöglicht wird.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt eine skalierbare, kostengünstige Methode dar, die auf mehrere Projekte und Modellsysteme anwendbar ist und keine dedizierten mikrofluidischen Plattformen erfordert.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem technisches Rauschen bei der cDNA-Synthese aus limitierenden RNA-Eingabemengen reduziert wird.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit von Einzelzell-Genexpressions-Workflows unter Verwendung standardmäßiger Laborgeräte.
- Strategischer Wert: Verbessert die Qualität von Go/No-Go-Entscheidungen, indem eine umfassendere molekulare Profilierung pro Probe ermöglicht wird, wodurch biologische falsch-negative Ergebnisse verringert werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung, indem das Vertrauen in Daten zur Target-Bindung und Pfadmodulation aus Einzelzellanalysen gesteigert wird.
Durchführungsaspekte
- Setzt Vertrautheit mit den Prinzipien der akustischen Mikroströmung und der Optimierung von Frequenz- und Amplitudenparametern für spezifische Reaktionsvolumina voraus.
- Hängt von dem Zugang zu einem temperaturgeregelten Inkubator und kompatiblen dünnwandigen PCR-Röhrchen für eine effektive Meniskusbildung ab.
- Erfordert die Standardisierung von Mischdauer und Leistungseinstellungen zwischen verschiedenen Anwendern, um reproduzierbare cDNA-Ausbeuten sicherzustellen.
- Beinhaltet die Validierung der Nukleinsäureintegrität nach dem Mischen, um das Fehlen einer Degradation durch mechanische oder thermische Einflüsse zu bestätigen.
- Auf Anwendungen beschränkt, bei denen eine erhöhte cDNA-Ausbeute die analytische Empfindlichkeit in nachgeschalteten Verfahren direkt verbessert, wie beispielsweise bei der qPCR oder der Vorbereitung von Sequenzierbibliotheken.
