JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Neurowissenschaften
0 Aufrufe • 3:08 Min. • July 8th, 2025
Nehmen Sie die Körperwand von Drosophila-Larven, die aus Muskeln besteht, die von Motoneuronen innerviert werden, um neuromuskuläre Verbindungen oder NMJs zu bilden.
Die postsynaptische Muskelmembran am NMJ enthält interagierende membrangebundene Proteine, die mit primären Antikörpern markiert sind.
Fügen Sie Proximity-Ligation-Assays (PLA)-Sonden hinzu, die Sekundärantikörper enthalten, die an einzelsträngige Oligonukleotide konjugiert sind. Inkubieren, damit die Sonden an die primären Antikörper binden können.
Waschen Sie alle ungebundenen Sonden weg.
Inkubieren Sie mit einem Ligationspuffer, der Konnektor-Oligonukleotide und Ligase-Enzyme enthält.
Die Nähe der interagierenden Proteine erleichtert die Bindung von Konnektoren an Sonden. Die Ligase versiegelt dann die Lücken und erzeugt zirkuläre DNA.
Waschen Sie alle ungebundenen Verbinder weg.
Inkubieren Sie mit einer Amplifikationslösung, die Polymerase enthält, die die zirkuläre DNA durch Rolling-Circle-Amplifikation amplifiziert.
Fluorophor-markierte Detektorsonden in der Lösung glühen an der amplifizierten DNA und erzeugen bei Anregung ein Fluoreszenzsignal.
Montieren Sie die Körperwand auf einem Objektträger, um fluoreszenzmarkierte Protein-Protein-Wechselwirkungen am NMJ sichtbar zu machen.
Zu Beginn des Assays geben Sie eine Verdünnung von 1 bis 5 in mindestens 200 Mikrolitern Gesamtvolumen sowohl der PLA-Sonde Anti-Maus minus als auch der PLA-Sonde Anti-Kaninchen plus in 1 % BSA zu den Körperwänden. Zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren.
Nachdem Sie die Körperwände mit Waschpuffer A zweimal für jeweils 5 Minuten gewaschen haben, fügen Sie eine Verdünnung von 1 bis 40 Ligase in Ligaselösung hinzu. Eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubieren.
Nach der Inkubation waschen Sie die Körperwände mit Waschpuffer A zweimal für jeweils 2 Minuten, bevor Sie eine Polymerase-Verdünnung von 1 bis 80 in die Amplifikationslösung geben. Zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren.
Um die Proben für die Bildgebung vorzubereiten, verwenden Sie Waschpuffer B, um die Körperwände zweimal für jeweils 10 Minuten zu waschen. Verwenden Sie dann eine 100-fache Verdünnung von Waschpuffer B, um eine letzte Wäsche für 1 Minute durchzuführen. Äquilibrieren Sie die Karosseriewände mindestens 30 Minuten lang in ein paar Tropfen Einbettlösung.
Übertragen Sie die Körperwände mit einer feinen Pinzette vorsichtig mit der Nagelhaut nach unten auf einen Objektträger. Positionieren Sie sie in Reihen in der gleichen Ausrichtung innerhalb von ein oder zwei Tropfen Montagelösung. Legen Sie ein 22 Millimeter x 40 Millimeter großes Deckglas über das Präparat und achten Sie darauf, dass keine Luftblasen entstehen. Verwenden Sie dann klaren Nagellack, um die Folie zu versiegeln.