JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Neurowissenschaften
0 Aufrufe • 3:08 Min. • July 8th, 2025
Nehmen Sie die Körperwand von Drosophila-Larven, die aus Muskeln besteht, die von Motoneuronen innerviert werden, um neuromuskuläre Verbindungen oder NMJs zu bilden.
Die postsynaptische Muskelmembran am NMJ enthält interagierende membrangebundene Proteine, die mit primären Antikörpern markiert sind.
Fügen Sie Proximity-Ligation-Assays (PLA)-Sonden hinzu, die Sekundärantikörper enthalten, die an einzelsträngige Oligonukleotide konjugiert sind. Inkubieren, damit die Sonden an die primären Antikörper binden können.
Waschen Sie alle ungebundenen Sonden weg.
Inkubieren Sie mit einem Ligationspuffer, der Konnektor-Oligonukleotide und Ligase-Enzyme enthält.
Die Nähe der interagierenden Proteine erleichtert die Bindung von Konnektoren an Sonden. Die Ligase versiegelt dann die Lücken und erzeugt zirkuläre DNA.
Waschen Sie alle ungebundenen Verbinder weg.
Inkubieren Sie mit einer Amplifikationslösung, die Polymerase enthält, die die zirkuläre DNA durch Rolling-Circle-Amplifikation amplifiziert.
Fluorophor-markierte Detektorsonden in der Lösung glühen an der amplifizierten DNA und erzeugen bei Anregung ein Fluoreszenzsignal.
Montieren Sie die Körperwand auf einem Objektträger, um fluoreszenzm
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