Bestimmung des Calciumretentionsvermögens isolierter Mitochondrien

Legen Sie die aus Neuroblastomzellen isolierten Mitochondrien in einen Puffer, der membranundurchlässigen, calciumbindenden Fluoreszenzfarbstoff enthält.

Inkubieren, damit sich die Mitochondrien im Puffer stabilisieren können.

Calciumhaltigen Puffer zugeben und unter Schütteln inkubieren.

Die Kalziumionen binden an die Farbstoffmoleküle und bewirken deren Fluoreszenz.

Überwachen Sie mit einem Fluoreszenzspektrometer die Fluoreszenz des Farbstoffs in Echtzeit.

Injizieren Sie nun in regelmäßigen Abständen kalziumhaltigen Puffer

.

Die erhöhte Kalziumkonzentration fördert die mitochondriale Kalziumaufnahme und reduziert die freien Kalziumionen, die zur Bindung an den Farbstoff zur Verfügung stehen, was zu einer verminderten Fluoreszenz führt.

Sobald die Mitochondrien ihre maximale Kalziumspeicherkapazität erreicht haben, löst eine weitere Kalziumzugabe die Öffnung der mitochondrialen Permeabilitätsübergangspore (mPTP) aus.

Diese Porenöffnung gibt Kalzium aus den Mitochondrien an den Puffer ab, wo es an den Farbstoff bindet und eine erhöhte Fluoreszenz verursacht.

Bestimmen Sie die Gesamtmenge an Kalzium, die zur Induktion der mPTP-Öffnung erforderlich ist, die die mitochondriale Kalziumretentionskapazität widerspiegelt.

Bereiten Sie das Kaliumchlorid-Medium vor und fügen Sie den kalziumbindenden grünen Fluoreszenzfarbstoff vor dem Experiment in einer Endkonzentration von 0,5 Mikromolar hinzu. Um die mitochondriale Calciumretentionskapazität zu bestimmen, übertragen Sie zunächst 1 Milliliter isolierter Mitochondrien in Kaliumchloridmedien, die 0,5 mikromolare calciumbindende grüne Fluoreszenzfarbstoffe enthalten, in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte.

Inkubieren Sie die Mitochondrien mit dem kalziumbindenden grünen Fluoreszenzfarbstoff in der 6-Well-Platte bei Raumtemperatur. Schützen Sie es 1 Minute lang vor Umgebungslicht. Nach der Inkubation geben Sie 4 Mikroliter Aliquots einer 20-millimolaren Calciumchloridlösung in jede Vertiefung der 6-Well-Platte, indem Sie die automatische Dispensiereinstellung verwenden, um 200 Nanomol Kalzium pro Milligramm mitochondrialem Protein einzuführen.

Verwenden Sie ein Fluoreszenzspektrometer, um die Fluoreszenzänderungen alle drei Sekunden für 2 Minuten mit einer Anregungswellenlänge von 506 Nanometern und einer Emissionswellenlänge von 531 Nanometern zu überwachen. Die Platte ist mit einem Schütteln bei 600 U/min für 3 Sekunden zwischen den Messwerten ausgestattet, das per Software gesteuert wird. Geben Sie ein zusätzliches 4-Mikroliter-Aliquot von 20 Millimolaren Calciumchloridlösung in jede Vertiefung und überwachen Sie dann die Fluoreszenzänderungen alle 3 Sekunden für 2 Minuten.