Untersuchung des Transports von Membranproteinen in Drosophila-Photorezeptorzellen

Nimm eine dunkelangepasste, anästhesierte, transgene, weißäugige Fliege.

Die Fliege exprimiert eGFP-markierte TRPL-Ionenkanäle in den Photorezeptoren des Auges.

In der Dunkelheit lokalisiert sich TRPL an den Membranen der Rhabdomere—den Mikrovilli der Photorezeptoren.

Schieben Sie die Fliege mit Druckluft kopfüber in eine Pipettenspitze.

Schneide die Spitze ab und schiebe den Hosenschlitz nach hinten.

Schneiden Sie es erneut und schieben Sie den Flyer nach vorne, bis nur noch sein Kopf herausragt.

Immobilisieren Sie die Spitze in Modelliermasse, die auf einem Objektträger haftet, und legen Sie sie auf einen Fluoreszenzmikroskoptisch, wobei das Auge radial zum Mikroskopobjektiv zeigt.

Geben Sie einen Tropfen Wasser in das Objektiv und senken Sie es dann ab, bis es das Auge berührt.

Nimm Bilder der Photorezeptoren auf.

Messen Sie die Fluoreszenzintensitäten in den Rhabdomen, im Zellkörper und im Hintergrund.

Beleuchten Sie die Fliege mit orangefarbenem Licht, um die TRPL-Translokation zum Zellkörper zu induzieren.

Wiederholen Sie die Bildgebungs- und Fluoreszenzmessungen.

Vergleichen Sie die Bilder, um eine reduzierte rhabdomerale Fluoreszenz nach der Beleuchtung zu beobachten, was auf eine TRPL-Translokation in den Zellkörper hinweist.

Um eine Fliege in einer nicht-letalen Variante zu präparieren, übertragen Sie die eisbetäubte Fliege kopfüber in eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze und schieben Sie die Fliege vorsichtig mit Druckluft in Richtung der Spitze. Schneiden Sie dann mit einem Skalpell die Pipettenspitze direkt vor dem Kopf ab. Und schieben Sie den Hosenschlitz mit einer Pinzette vorsichtig einige Millimeter in die Pipettenspitze.

Schneiden Sie die Pipettenspitze wieder ab. Und schieben Sie die Fliege mit der Druckluft zurück in Richtung Spitze, so dass nur noch der Kopf der Fliege aus der Pipettenspitze herausragt. Nachdem Sie ein Stück Plastilin auf einen Objektträger geklebt haben, drücken Sie die Pipettenspitze so hinein, dass das linke oder rechte Auge nach oben zeigt. Stellen Sie sicher, dass das Auge unter dem Mikroskop richtig ausgerichtet ist. Wählen Sie für die Bildaufnahme ein Wasserimmersionsobjektiv.

Im Falle einer nicht-letalen Variante verwenden Sie eine Laborpipette, um einen großen Tropfen gekühltes Wasser auf die Unterseite des Wasserimmersionsobjektivs zu kleben. Legen Sie den Objektträger mit der vorbereiteten Fliege vorsichtig auf den Mikroskoptisch. Senken Sie dann das Wasserimmersionsobjektiv manuell ab, bis es die Wasseroberfläche berührt oder das Auge der Fliege den Tropfen berührt.

Schalten Sie dann den Lichtweg in Richtung der Mikroskopkamera und erzeugen Sie ein Live-Bild. Stellen Sie den Fokus für die Kamera neu ein und bewerten Sie die Ausrichtung des Auges, wobei zu berücksichtigen ist, dass das Auge radial auf das Mikroskopobjektiv gerichtet sein muss. Verwenden Sie die Lookup-Table-Software, um eine Übersättigung zu erkennen.

Bei unpigmentierten Fliegen passen Sie die Belichtungszeit so an, dass die hellsten Pixel bei jedem Bild knapp unter der Sättigungsgrenze liegen. Nehmen Sie ein Bild auf und speichern Sie es als Rohdatei, um alle entsprechenden Metadaten der Aufnahme zu archivieren. Exportieren Sie dann das Bild in ein Punkt-TIFF-Format.

Um die relative EGFP-Fluoreszenz in den Rhabdomen von Wasser-Immersionsmikroskopien zu quantifizieren, passen Sie die ImageJ-Einstellungen an, indem Sie auf Analysieren klicken. Legen Sie dann die Messungen fest und aktivieren Sie nur das Kontrollkästchen für den mittleren Grauwert. Importieren Sie das Punkt-TIFF-Bild, indem Sie auf Datei und dann auf Öffnen klicken. Wählen Sie einen repräsentativen Bereich des Bildes im Fokus aus und vergrößern Sie ihn auf 200 % bis 300 %, indem Sie wiederholt die Tastenkombination "ctrl" und "Plus" drücken.

Wählen Sie als Nächstes das ovale Werkzeug aus. Und während Sie die Umschalttaste drücken, erzeugen Sie eine kreisförmige Auswahl im Bild, die deutlich kleiner ist als ein fluoreszierendes Rhabdomer. Suchen Sie dann nach der genauen Größe, die unter der Symbolleiste im ImageJ-Hauptfenster angezeigt wird. Um die Fluoreszenzintensitäten innerhalb der kreisförmigen Auswahl zu messen, verschieben Sie den Kreis mit den Pfeiltasten auf der Tastatur auf den ersten Rhabdomer, klicken Sie auf Analysieren und dann auf Messen.

Es öffnet sich ein Ergebnisfenster, in dem der gemessene Grauwert aufgelistet ist. Fahren Sie mit der Messung der Rhabdomeren 2 bis 6 fort und messen Sie auch das Hintergrundsignal. Bei nicht pigmentierten Fliegen nehmen Sie zusätzliche Messungen der entsprechenden Zellkörperbereiche vor. Messen Sie die Fluoreszenz von zwei weiteren Ommatidien, was zu drei technischen Replikaten führt. Markieren Sie die analysierten Ommatidien mit dem Bleistiftwerkzeug und speichern Sie dieses Bild zur Dokumentation.

Wählen Sie die gemessenen Grauwerte aus dem Ergebnisfenster aus, kopieren Sie sie und fügen Sie sie für weitere Berechnungen in eine Tabellenkalkulationssoftware ein. Sortieren Sie die Fluoreszenzintensitätswerte nach ihrem Ursprung in das Rhabdom, den Zellkörper und den Hintergrund der Kategorie und berechnen Sie die mittlere Intensität aus jeder Kategorie. Berechnen Sie dann die relative Menge an EGFP im Rhabdomer, indem Sie die erste Formel für nicht pigmentierte Augen und die zweite für pigmentierte Augen verwenden.