LC-MS/MS Analyse des proteomischen Profils von Neuromelanin-Granulaten, die aus menschlichem Hirngewebe isoliert wurden

Beginnen Sie mit Peptiden, die aus Neuromelanin-Granulaten (NMGs) gewonnen wurden, die aus postmortalem menschlichem Gehirngewebe isoliert wurden.

NMGs, die in Dopamin-produzierenden Neuronen vorkommen, enthalten Neuromelanin-Pigmente, Proteine und Lipide.

Nehmen Sie eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)-Säule, die eine stationäre Phase auf Siliziumdioxidbasis enthält, die mit hydrophoben Liganden funktionalisiert ist.

Laden Sie die Peptide auf die Säule.

Hydrophobe Peptide binden stärker an die Säule als hydrophile.

Leitet einen Elutionspuffer durch die Spalte.

Weniger hydrophobe Peptide eluieren zuerst, während mehr hydrophobe Peptide später eluieren.

Die eluierten Peptide gelangen in die Elektrospray-Ionisationsquelle des Massenspektrometers, wo sie in geladene Peptidionen ionisiert werden.

Die ionisierten Peptide gelangen dann in den Massenanalysator, wo sie auf der Grundlage ihres Masse-zu-Ladungs-Verhältnisses getrennt werden.

Ein ausgewähltes Peptidion wird zur Kollisionszelle geleitet und in kleinere Ionen fragmentiert, deren Masse-Ladungs-Verhältnis erneut gemessen wird.

Schließlich werden die Daten mit einer Referenzdatenbank verglichen, um die in der NMG-Probe vorhandenen Proteine zu identifizieren.

Nach dem tryptischen Aufschluss, wie im Text beschrieben, bereiten Sie die Probe für die HPLC-MS-Analyse vor, indem Sie 200 bis 400 Nanogramm Probenpeptide in einem definierten Volumen von 0,1% TFA in inerten massenspektrometrischen Glasfläschcheneinlässen auflösen. Wenn die Konzentrationsbestimmung aufgrund einer geringen Probenmenge nicht anwendbar ist, überprüfen Sie die identische Probenbelastung, indem Sie den Gesamtionenstrom vergleichen.

Um mit der Analyse der proteomischen Rohdaten zu beginnen, klicken Sie auf Laden, um die Rohdateien in die Software zu laden. Klicken Sie auf Experiment setzen, um die Stichprobennamen zuzuweisen. Um gruppenspezifische Parameter zu definieren, fügen Sie die Modifikationen hinzu, indem Sie Deamidation NQ, Oxidation M und Carbaminomethylation N-Term als Variablenmodifikationen auswählen. Und dann fügen Sie Carbaminomethylierung C als feste Modifikation hinzu. Wählen Sie Trypsin als Verdauungsenzym in der Registerkarte "Verdauung".

Im etikettenfreien Quantifizierungs-Tab. Fügen Sie die Option LFQ hinzu. Und wenn mehr als 10 Dateien verarbeitet werden sollen, wählen Sie die schnelle LFQ-Option, um die Verarbeitungszeit zu verkürzen. Um sicherzustellen, dass alle anderen gruppenspezifischen Parameter in den Werkseinstellungen bleiben, fahren Sie mit der Registerkarte Globale Parameter fort und fügen Sie die von uniprot.org abgeleitete FASTA-Datei auf der Registerkarte Sequenzen hinzu. Ändern Sie die Bezeichnerregel entsprechend, und fügen Sie die Taxonomie-ID 9606 für Homo sapiens hinzu.

Für die Proteinquantifizierung wählen Sie einzigartige und rasierte Peptide. Fügen Sie dann die iBAQ-Option als Maß für die Proteinquantifizierung auf der Registerkarte Markierungsfreie Quantifizierung hinzu. Stellen Sie sicher, dass alle anderen globalen Parameter in den Werkseinstellungen bleiben, und klicken Sie auf Start. Nachdem die Analyse erfolgreich durchgeführt wurde, rufen Sie die .txt Ausgabe der Proteingruppe ab.