JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Neurowissenschaften
0 Aufrufe • 2:38 Min. • April 28th, 2025
Nimm neuroendokrine Dünndarmtumor-Sphäroide in einer Tube.
Füge eine Fixierlösung hinzu, um die Zellen zu erhalten.
Zum Waschen, zentrifugieren und das Fixiermittel durch Puffer ersetzen.
Zentrifugen und den Überstand entsorgen, um das restliche Fixiermittel zu entfernen.
Füge einen Puffer hinzu, der Detergens und ein Blockierungsmittel enthält, um die Zellmembranen zu permeabilisieren und unspezifische Antikörperbindungen zu verhindern.
Mit Puffer waschen, um überschüssiges Waschmittel und Blockiermittel zu entfernen.
Inkubieren Sie mit primären Antikörpern, die an das für die neuroendokrine Zelle spezifische Zielprotein binden.
Mit Puffer waschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen.
Fluorophor-markierte Sekundärantikörper hinzufügen, die an die primären Antikörper binden.
Mit Puffer spülen, um überschüssige Antikörper zu entfernen.
Füge ein Einbettmedium hinzu, das einen Farbstoff enthält, um den Zellkern zu färben.
Übertragen Sie die Sphäroide auf eine Folie und montieren Sie sie mit einem Deckglas.
Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop, um neuroendokrine Zellen des Sphäroids zu visualisieren, die spezifische Proteine exprimieren.
Fixiere die Organoide, indem du 500 Mikroliter Paraformaldehyd hinzugibst und sie 15 Minuten lang inkubierst. Waschen Sie die Kultur nach der Inkubation zweimal mit 1 Milliliter PBS. Fügen Sie 500 Mikroliter PBS mit 3 % BSA und 0,1 % Triton X-100 hinzu, um die Kultur zu permeabilisieren. Inkubieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang, dann waschen Sie die Organoide dreimal mit 1 Milliliter PBS und 3% BSA.
Als nächstes inkubieren Sie die Kultur eine Stunde lang mit primären Antikörpern und wiederholen dann die Waschgänge mit PBS und BSA. Inkubieren Sie mit den Sekundärantikörpern und wiederholen Sie die Waschungen, wobei Sie darauf achten, dass alle Überstände aspiriert und verworfen werden.
Um die Sphäroide abzubilden, fügen Sie 5 Mikroliter Einbettmedium hinzu, das DAPI enthält, und verwenden Sie eine P20-Pipette, um 5 Mikroliter der Sphäroide auf einen Objektträger zu übertragen. Versiegeln Sie den Objektträger mit einem Deckglas und nehmen Sie die Aufnahme mit einem Fluoreszenzmikroskop mit den 10-, 20- und 40-fach-Objektiven auf.