JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Neurowissenschaften
0 Aufrufe • 5:25 Min. • April 28th, 2025
Nimm ein Zelllysat, das Kaliumchlorid-Cotransporter 2 oder KCC2-Proteine enthält, die den neuronalen Chloridspiegel regulieren.
Phosphorylierung an regulatorischen Stellen stört die KCC2-Funktion und moduliert die neuronale Aktivität.
Füge das Lysat zu Kügelchen hinzu, die mit Antikörpern konjugiert sind, die auf phosphoryliertes KCC2 abzielen. Inkubieren, um eine Bindung zu ermöglichen, und dann waschen, um ungebundene Proteine und Zelltrümmer zu entfernen.
Mit einem denaturierenden Puffer bei hoher Temperatur behandeln, um KCC2 freizusetzen, dann zentrifugieren, um die Kügelchen zu trennen.
Laden Sie den KCC2-haltigen Überstand auf ein Elektrophorese-Gel. Trennen Sie die Proteine in Banden, um das Vorhandensein von phosphoryliertem KCC2 zu bestätigen.
Übertragen Sie die Banden auf eine Membran und inkubieren Sie dann in einer Blocklösung, um unspezifische Bindungsstellen zu maskieren.
Inkubieren Sie mit primären Antikörpern, die auf phosphoryliertes KCC2 abzielen.
Waschen, dann mit enzymmarkierten Sekundärantikörpern inkubieren, um die Primärantikörper zu markieren.
Erneut waschen, dann ein chemilumineszierendes Substrat hinzufügen, das mit dem Enzym reagiert, um Licht zu erzeugen.
Messe
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