Nachweis des phosphorylierten neuronalen Kalium-Chlorid-Cotransporters 2 mittels Western Blotting

Nimm ein Zelllysat, das Kaliumchlorid-Cotransporter 2 oder KCC2-Proteine enthält, die den neuronalen Chloridspiegel regulieren.

Phosphorylierung an regulatorischen Stellen stört die KCC2-Funktion und moduliert die neuronale Aktivität.

Füge das Lysat zu Kügelchen hinzu, die mit Antikörpern konjugiert sind, die auf phosphoryliertes KCC2 abzielen. Inkubieren, um eine Bindung zu ermöglichen, und dann waschen, um ungebundene Proteine und Zelltrümmer zu entfernen.

Mit einem denaturierenden Puffer bei hoher Temperatur behandeln, um KCC2 freizusetzen, dann zentrifugieren, um die Kügelchen zu trennen.

Laden Sie den KCC2-haltigen Überstand auf ein Elektrophorese-Gel. Trennen Sie die Proteine in Banden, um das Vorhandensein von phosphoryliertem KCC2 zu bestätigen.

Übertragen Sie die Banden auf eine Membran und inkubieren Sie dann in einer Blocklösung, um unspezifische Bindungsstellen zu maskieren.

Inkubieren Sie mit primären Antikörpern, die auf phosphoryliertes KCC2 abzielen.

Waschen, dann mit enzymmarkierten Sekundärantikörpern inkubieren, um die Primärantikörper zu markieren.

Erneut waschen, dann ein chemilumineszierendes Substrat hinzufügen, das mit dem Enzym reagiert, um Licht zu erzeugen.

Messen Sie die Lichtintensität, um phosphoryliertes KCC2 im Lysat zu quantifizieren.

Pipettieren Sie 300 Mikroliter Protein G Sepharose in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie dann die Lösung zwei Minuten lang bei 500 g. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, fügen Sie 500 Mikroliter PBS hinzu und wirbeln Sie es gut ein. Entsorgen Sie den Überstand nach der Zentrifugation und wiederholen Sie diesen Schritt.

Mischen Sie als nächstes 1 Milligramm Anti-KCC2-Threonin 906 und Anti-KCC2 Threonin 1007 Antikörper mit 200 Mikrolitern Protein-G-Sepharosekügelchen, bevor Sie das Volumen mit PBS auf 500 Mikroliter auffüllen. Wiederholen Sie nach dem zweistündigen Schütteln auf einer vibrierenden Plattform oder einem rotierenden Rad bei 4 Grad Celsius zwei Wäschen mit PBS.

Führen Sie eine Proteinquantifizierung an den Zelllysaten durch und fügen Sie 1 Milligramm des Zelllysats zu den gewaschenen Kügelchen hinzu und inkubieren Sie in einem End-to-End-Rotator, bevor Sie sich drehen. Geben Sie drei Waschgänge mit PBS mit 150 millimolarem Natriumchlorid, gefolgt von drei Waschgängen mit 200 Mikrolitern PBS, bevor Sie das endgültige Pellet in 100 Mikrolitern LDS-Probenpuffer resuspendieren.

Schütteln Sie die Röhren in einem Rotorschüttler bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Inkubieren Sie sie in einem Heizblock und zentrifugieren Sie sie, bevor Sie den Überstand zum Laden des Gels verwenden. Bauen Sie das Western-Blot-Gießgerät zusammen und gießen Sie frisch vorbereitetes 8%iges Trenngel zum Gießen des Gels, wobei Sie etwa 2 Zentimeter Abstand von der Oberseite des Gießglases lassen. Geben Sie 200 Mikroliter absolutes Isopropanol in das Setup und lassen Sie es 60 Minuten bei Raumtemperatur stehen.

Entfernen Sie das Isopropanol mit einer Pipette und spülen Sie das Gel vorsichtig mit etwa 200 Mikrolitern destilliertem Wasser aus. Nach dem Hinzufügen von frisch zubereitetem 6%igem Stapelgel zum Casting-Setup vorsichtig in den gut gefüllten Kamm legen und 30 Minuten bei Raumtemperatur ziehen lassen. Fixieren Sie dann das gegossene Gel im Elektrophoresetank.

Nachdem Sie den laufenden Puffer in den Tank gegossen haben, laden Sie 5 Mikroliter Molekulargewichtsmarker in die erste Vertiefung und eine gleiche Menge Protein in jede Vertiefung des SDS-PAGE-Gels. Füllen Sie die leeren Vertiefungen mit LDS und lassen Sie das Gel etwa 90 bis 120 Minuten lang bei 120 Volt laufen. Rehydrieren Sie die Nitrozellulosemembran mit einem Transferpuffer mit 20 % Methanol.

Spülen Sie das Gel und die Membran mit dem Transferpuffer ab und verteilen Sie sie vorsichtig auf dem Vorbereitungsstapel. Ordnen Sie das zu übertragende Sandwich in dieser Reihenfolge an, negative Elektrode, Sandwichschaum, Filterpapier, gespültes SDS-PAGE-Gel, gespülte Nitrozellulosemembran, Filterpapier, Sandwichschaum, positive Elektrode. Wenn Sie fertig sind, stapeln Sie das zusammengebaute Sandwich im Transfertank und lassen Sie es 90 Minuten lang mit 90 Volt oder 360 Minuten lang mit 30 Volt laufen.

Blockieren Sie die trockene Membran für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit einem Blockierungspuffer. Die Membranen werden mit geeigneten Verdünnungen von Primärantikörper und Beta-Aktin in einem Blockpuffer für 1 Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 Grad Celsius inkubiert. Geben Sie dann drei Wäschen TBST für jeweils 5 Minuten.

Inkubieren Sie die gewaschene Membran mit einem in einem Blockierungspuffer verdünnten Sekundärantikörper für 60 Minuten und wiederholen Sie drei Waschgänge TBST. Wenn Sie fertig sind, legen Sie die gewaschene Membran auf die Bildgebungsplatine. Um die Signale zu entwickeln, verteilen Sie die vorbereitete Lösung, indem Sie gleiche Voluminaden jedes verstärkten Chemilumineszenzreagenzes auf der Membran mischen, bevor Sie die Bildgebungsplatine zur Bildgebung auf das Bildgebungssystem übertragen.