Quantifizierung von retinalen Ganglienzellsomen nach kauterisationsinduzierter okulärer Hypertonie

0 Ansichten3:06 Min. • April 28th, 2025

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Nimm eine chemisch fixierte Netzhaut, die aus dem Auge einer Ratte isoliert wurde.

Das Auge weist eine hitzeinduzierte Schädigung des limbalen Gefäßplexus auf, einem Netzwerk von Blutgefäßen, das die Hornhaut umgibt.

Dieser Schaden blockiert den Flüssigkeitsabfluss, erhöht den Augeninnendruck (IOD) und führt zur Degeneration der retinalen Ganglienzellen (RGC).

Behandeln Sie die Netzhaut mit einer Permeabilisierungslösung, um die Zell- und Kernmembranen zu permeabilisieren.

Wenden Sie eine Blockierungslösung an, um eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern.

Entfernen Sie die blockierende Lösung.

Primäre Antikörper einführen, die auf einen Transkriptionsfaktor abzielen, der überwiegend in RGCs exprimiert wird.

Waschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen.

Fluorophor-konjugierte Sekundärantikörper einführen, die an die Primärantikörper binden.

Waschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen.

Gegenfärbung der Zellkerne mit einem DNA-bindenden Farbstoff.

Waschen Sie die Netzhaut und montieren Sie sie mit einem geeigneten Eindeckmedium auf einen Objektträger.

Visualisieren Sie die Netzhaut unter einem Epifluoreszenzmikroskop.

Eine im Vergleich zur Kontrolle reduzierte Zelldichte im geschädigten Auge bestätigt eine RGC-Degeneration aufgrund eines erhöhten IOD.

Nachdem du die Netzhaut isoliert hast, übertrage sie in eine 24-Well-Kulturplatte mit 1 Milliliter PBS, wobei die innere Netzhaut nach oben zeigt. Permeabilisieren Sie das Gewebe durch Waschen mit einem 0,5%igen nichtionischen Tensid, das in PBS verdünnt ist. Inkubieren Sie das Gewebe dann eine Stunde lang in Blockierlösung bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. Während der Inkubation BRM 3A Primärantikörperlösung vorbereiten und bei 4 Grad Celsius lagern.

Nach dem Blockieren des Gewebes inkubieren Sie die Netzhaut in 200 Mikrolitern primärer Antikörperlösung bei 4 Grad Celsius für 72 Stunden unter leichtem Schütteln. Waschen Sie anschließend das Taschentuch mit PBS. Inkubieren Sie das Gewebe zwei Stunden lang bei Raumtemperatur in 200 Mikrolitern der Sekundärantikörperlösung und anschließend 10 Minuten lang mit einer nuklearen Gegenfärbelösung für die Fluoreszenzkernfärbung.

Nach drei PBS-Wäschen übertragen Sie die Netzhaut mit zwei kleinen Pinseln auf einen Glasobjektträger, wobei Sie die Glaskörperseite nach oben halten. Positionieren Sie den dorsalen Netzhautquadranten nach oben auf dem Objektträger. Tragen Sie zum Schluss 200 Mikroliter Anti-Fade-Eindeckmittel auf ein Glasdeckglas auf und legen Sie es für die mikroskopische Analyse auf die flach montierte Netzhaut. Untersuchen Sie unter einem konfokalen Epifluoreszenzmikroskop mit einem Objektiv mit 40-facher Vergrößerung die flachen Halterungen, um retinale Ganglienzellen zu schätzen.

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Zuletzt aktualisiert: 22 August 2026