Beurteilung der exzitatorischen Neurotransmitterspiegel bei chronischen Epilepsie-induzierten Ratten

Nehmen Sie eine Kontrollratte und eine chronische Epilepsie-induzierte Ratte, die mit einer Führungskanüle und einer Elektroenzephalogramm oder EEG-Elektrode in den Hippocampus implantiert wurden.

Epilepsie-Induktion erhöht die exzitatorische Neurotransmitterfreisetzung, was zu einem Ioneneinstrom in postsynaptische Zellen führt, der kontinuierliche exzitatorische Potentiale erzeugt. Dies führt zu synchronisierten Ausbrüchen elektrischer Aktivität, sogenannten Anfällen, die mit der Elektrode aufgezeichnet werden.

Führe eine Mikrodialysesonde mit einer semipermeablen Membran in die Kanüle ein.

Binde die Ratte an den Käfig eines EEG-Aufzeichnungssystems.

Injiziere einen physiologischen Puffer über den Sondeneinlass in das Gehirngewebe

Stellen Sie sicher, dass keine Anfälle auftreten und sammeln Sie extrazelluläre Flüssigkeit über den Sondenauslass, um den Neurotransmitterspiegel zu beurteilen.

Ein erhöhter Basalspiegel bei der epileptischen Ratte deutet auf einen Epilepsie-vermittelten Anstieg hin.

Einen Puffer mit hohem Kaliumgehalt infundieren und Proben neu sammeln.

Das erhöhte Kalium verlängert die neuronale Erregbarkeit und löst eine kontinuierliche Freisetzung von Neurotransmittern aus.

Ein vorübergehender Anstieg der Neurotransmitterspiegel sowohl bei den epileptischen als auch bei den Kontrollratten deutet auf einen hohen Kalium-induzierten Anstieg hin.

Bereiten Sie zunächst die Mikrodialysesonden gemäß der Bedienungsanleitung des Herstellers für den ersten Gebrauch vor und füllen Sie sie mit Ringerlösung. Schneiden Sie dann 10 Zentimeter lange Stücke FEP-Schläuche ab und verbinden Sie sie mit den Schlauchadaptern in verschiedenen Farben mit den Einlass- und Auslasskanülen der Sonde. Stellen Sie sicher, dass der Schlauch die Adapter berührt und keine Toträume in allen Anschlüssen vorhanden sind.

Nehmen Sie die Schnullerkanüle mit der Pinzette aus der Führung, indem Sie den Kopf des Tieres festhalten. Führen Sie die Mikrodialysesonde in die Führungskanüle ein und verwenden Sie Modelliermasse, um die Kanüle weiter zu festigen. Verbinden Sie als Nächstes das Tier mit dem angebundenen EEG-Aufzeichnungssystem. Setze dann das Tier in den Plexiglaszylinder und lass es die neue Umgebung erkunden. Verfolgen Sie die wachen und sich frei bewegenden Rattenbewegungen.

Verbinden Sie dann den Einlass der Sonde mit der 2,5-Milliliter-Spritze mit einer abgestumpften 22-Gauge-Nadel mit Ringerlösung unter Verwendung der Schlauchadapter. Drücken Sie in 10 Sekunden einen Milliliter Ringerlösung in die Sonde, indem Sie den Kolben der 2,5-Milliliter-Spritze kontinuierlich drücken. Prüfen Sie, ob der Tropfen der Flüssigkeit auf dem Auslass erscheint, um anzuzeigen, dass die Sonde betriebsbereit ist. Füllen Sie abschließend die 2,5-Milliliter-Spritzen, die mit den FEP-Schläuchen verbunden sind, mit Schlauchadaptern mit Ringerlösung auf und montieren Sie sie auf die Infusionspumpe. Starten Sie die Pumpe mit zwei Mikrolitern pro Minute und lassen Sie sie über Nacht laufen.

Nach der Überprüfung über Video-EEG-Aufzeichnungen, dass in den drei Stunden vor der Probenentnahme keine Anfälle aufgetreten sind, stoppen Sie die Pumpe mit den FEP-Schläuchen, die kanülierten Spritzen, die mit Ringerlösung gefüllt sind. Montieren Sie einen weiteren Satz 2,5-Milliliter-Spritzen, die mit FEP-Schläuchen verbunden sind, mit Schlauchadaptern, die mit einer modifizierten Ringerlösung gefüllt sind, die 100 millimolare Kaliumlösung enthält. Starten Sie die Pumpe mit 2 Mikrolitern pro Minute und lassen Sie sie laufen. Überprüfen Sie, ob das System keine Luftblasen enthält, und stellen Sie sicher, dass der Schlauch die Adapter ohne Totraum in allen Anschlüssen berührt.

Überprüfen Sie dann, ob der Tropfen der Flüssigkeit auf dem Auslass erscheint, um anzuzeigen, wann die Sonde einsatzbereit ist. Verbinden Sie als Nächstes den FEP-Schlauch der mit Ringerlösung gefüllten Spritzen mit der Einlasskanüle der Sonde bei jedem Tier und warten Sie, bis der Flüssigkeitstropfen an der Spitze des Auslasses erscheint. Verbinden Sie den Ausgang der Sonde mit dem FEP-Schlauch, der zur Sammlung im Reagenzglas führt.

Führen Sie den FEP-Schlauch in das geschlossene 0,2-Milliliter-Reagenzglas mit einer perforierten Kappe ein. Und stellen Sie sicher, dass das Rohr an Ort und Stelle bleibt, indem Sie es mit einem Stück Modelliermasse fixieren. Nachdem die Pumpe 60 Minuten lang mit 2 Mikrolitern pro Minute betrieben wurde, ohne Proben zur Äquilibrierung zu entnehmen, sammelte das System fünf aufeinanderfolgende 30-minütige Dialysatproben unter Ausgangsbedingungen. Und lagern Sie Proben auf Eis.

Wechseln Sie nach 10 Minuten den Schlauch von den Spritzen mit 100 millimolar Kaliumringerlösung auf normale Ringerlösung und lassen Sie die Pumpe laufen. Nach der Entnahme des fünften Dialysats nach der Äquilibrierung eine Stunde lang alle 10 Minuten 20 Mikroliter Dialysatfraktionen sammeln. Entnehmen Sie dann drei weitere 30-minütige Dialysatproben und stoppen Sie die Pumpe. Lagern Sie die Proben schließlich nach dem Experiment bis zur HPLC-Analyse bei minus 80 Grad Celsius.