JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowissenschaften
0 Ansichten • 2:34 Min. • April 28th, 2025
Nehmen Sie einen Objektträger mit einer Monolayer-Kultur aus mikrovaskulären Endothelzellen des Rattengehirns, kurz RBMECs.
Die Zellen sind durch Tight-Junction-Proteine verbunden, die mit dem Aktin-Zytoskelett verbunden sind und die Endothelschicht der Blut-Hirn-Schranke nachahmen.
Ersetzen Sie das Medium durch ein sauerstoffarmes, glukosefreies Medium und legen Sie dann den Objektträger in eine Hypoxiekammer.
Die Nichtverfügbarkeit von Sauerstoff und Glukose hemmt die ATP-Synthese. Das verbleibende ATP wird in Nukleotidderivate zerlegt.
ATP-Mangel behindert die Kalziumpumpen und erhöht das intrazelluläre Kalzium, das die Oxidoreduktase-Enzyme aktiviert.
Als nächstes füllst du das Objekt mit einem sauerstoffhaltigen Medium auf und legst es dann in einen sauerstoffhaltigen Inkubator. Die aktivierten Oxidoreduktasen nutzen den wieder eingeführten Sauerstoff, um die Nukleotidderivate abzubauen, wodurch reaktive Sauerstoffspezies oder ROS entstehen.
ROS unterbricht die Wechselwirkungen zwischen Tight-Junction-Proteinen und induziert Signalwege, die das Aktin-Zytoskelett in Stressfasern umgestalten, wodurch die Zell-Zell-Interaktionen geschwächt werden.
Die Monoschicht mit gestörten interzellulären Wechselwirkungen ist bereit für die Analyse.
Richten Sie zur Vorbereitung das Hypoxie-Zellkultursystem gemäß den Anweisungen des Herstellers ein und kalibrieren Sie es. Die Kammerumgebung sollte zu 95 % aus Stickstoff, zu 5 % aus Kohlendioxid und bei 37 Grad Celsius bestehen. Desoxygenieren Sie nun glukosefreies DMEM, indem Sie es für 4 bis 6 Stunden in die Hypoxiekammer legen. Beginnen Sie später, die Zellen zu stressen, indem Sie ihr Medium durch das sauerstoffarme, glukosefreie DMEM ersetzen. Und dann legen Sie die Zellen für zwei Stunden in die Hypoxiekammer. Nach zwei Stunden legen Sie die Zellen wieder auf das vollständige Medium der Endothelzellen des Rattengehirns. Versorgen Sie die Zellen dann wieder mit Sauerstoff, indem Sie sie für eine Stunde wieder in den normalen Zustand versetzen.