Hochauflösende Bildgebung von Neurotransmitter-Rezeptoren an retinalen Synapsen

Nehmen Sie einen Netzhautschnitt einer Maus auf einem Elektronenmikroskopiegitter. Der Abschnitt enthält retinale Ganglienzellen (RGCs), die synaptisch mit bipolaren Zellen verbunden sind.

Präsynaptische Bipolarzellen enthalten Neurotransmitter-Vesikel, die in einer Bandstruktur in der Nähe der synaptischen Membran angeordnet sind.

Postsynaptische RGCs weisen geclusterte Neurotransmitterrezeptoren auf ihrer Membran auf. Diese Zellen sind mit Choleratoxin Subunit B oder CTB markiert.

Mit einem Puffer waschen, um den pH-Wert zu halten.

Inkubieren Sie mit einem Blockierungspuffer, um unspezifische Bindungsstellen zu maskieren.

Inkubieren Sie mit primären Antikörpern, die auf die Neurotransmitterrezeptoren und CTB abzielen.

Mit einem Puffer waschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen und den pH-Wert zu halten.

Inkubieren Sie mit Sekundärantikörpern, die an Goldnanopartikel unterschiedlicher Größe konjugiert sind, die an die Primärantikörper binden und die Zielmoleküle markieren.

Entfernen Sie die ungebundenen Antikörper und trocknen Sie die Probe an der Luft.

Tragen Sie Schwermetalle auf, die Makromoleküle binden und den Kontrast verstärken.

Identifizieren Sie mit Hilfe der Elektronenmikroskopie die RGCs anhand der markierten CTBs und lokalisieren Sie die markierten Neurotransmitterrezeptoren.

Schneiden Sie in diesem Schritt 70 Nanometer dicke, ultradünne Schnitte mit einem Ultramikrotom und sammeln Sie sie auf den Formvar-kohlenstoffbeschichteten Nickelgittern. Waschen Sie die Gitter einmal in destilliertem Wasser, gefolgt von drei Wäschen TBS. Inkubieren Sie dann die Gitter 30 Minuten lang in 20 Mikrolitern 5 % BSA in TBS und dann über Nacht bei Raumtemperatur in 20 Mikrolitern einer Mischung, die Ziegen-Anti-CTB und einen Antikörper gegen eine NMDAR-Untereinheit enthält.

Danach wasche die Gitter dreimal mit 20 Mikrolitern TBS, jedes Mal bei pH 7,6. Waschen Sie die Gitter anschließend einmal fünf Minuten lang mit TBS bei pH 8,2. Inkubieren Sie die Gitter zwei Stunden lang mit 20 Mikrolitern einer Mischung, die Esel-Anti-Kaninchen-IgG enthält, gekoppelt mit 10-Nanometer-Goldpartikeln, und Esel-Anti-Ziegen-IgG, gekoppelt an 18-Nanometer-Goldpartikel

.

Nach zwei Stunden waschen Sie die Gitter dreimal in 20 Mikrolitern TBS bei pH 7,6, gefolgt von einer Wäsche im Reinstwasser. Und dann die Gitter an der Luft trocknen. Anschließend die Gitter acht Minuten lang mit 5 % Uranylacetat in destilliertem Wasser gegengefärbt, gefolgt von 0,3 % Bleicitrat in destilliertem Wasser für fünf Minuten im Dunkeln.