Echtzeit-Überwachung der Aktivierung von Geruchsrezeptoren in rekombinanten Zellen

Beginnen Sie mit einer Multi-Well-Platte, die adhärente rekombinante Säugetierzellen in einer Stimulationslösung enthält, die mit Luciferin, einem lumineszierenden Substrat, ergänzt wird.

Inkubieren, um Luciferin den Eintritt in die Zelle zu ermöglichen.

Diese Zellen exprimieren membrangebundene Geruchsrezeptoren, die mit olfaktorischen G-Proteinen und Rezeptor-Transportproteinen gekoppelt sind.

Zusätzlich exprimieren die Zellen zytoplasmatische Glosensor-Proteine, lumineszierende Proteine, die empfindlich auf zyklisches AMP reagieren.

Geben Sie eine verdampfbare Odorierlösung in den Raum zwischen den Vertiefungen und platzieren Sie die Platte in einem Luminometergerät, das mit demselben Odorant voräquilibriert ist.

Lumineszenzmessung starten.

Geruchsmoleküle binden an die Geruchsrezeptoren der Zellen, aktivieren das gekoppelte G-Protein und dissoziieren die α Untereinheit des G-Proteins oder Gα.

Die dissoziierte Gα-Untereinheit bindet an das membraneingebettete Adenylatcyclase-Enzym und aktiviert es. Das aktivierte Enzym wandelt die ATPs in zyklische AMPs um.

Diese cyclischen AMPs binden an Glosensorproteine, verändern deren Konformation und ermöglichen die Luciferin-Bindung.

Diese Interaktion erzeugt Lumineszenz, die die Aktivierung von Geruchsrezeptoren bestätigt.

Fügen Sie 75 Mikroliter der cAMP-Reagenzlösung hinzu. Entfernen Sie die Stimulationslösung aus den Vertiefungen und geben Sie 25 Mikroliter verdünnte cAMP-Reagenzlösung in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die 96-Well-Platte zwei Stunden lang bei Raumtemperatur in einer dunklen und geruchsfreien Umgebung.

Zuerst verdünnen Sie das Odormittel Acetophenon in 10 Millilitern Mineralöl auf 1% und verschließen das Röhrchen. Geben Sie vor Ablauf der Inkubationszeit des cAMP-Reagenzes 25 Mikroliter der Odorierlösung in eine neue 96-Well-Platte in jede Vertiefung. Legen Sie dann diese Odorierplatte für fünf Minuten in die Luminometerkammer, um die Kammer mit flüchtigen Odoriermolekülen auszugleichen. Stellen Sie das Luminometer so ein, dass die Lumineszenz während 20 Zyklen einer 90-Sekunden-Plattenmessung mit einem Intervall von 0,7 Sekunden zwischen den Zyklen mit null Sekunden Verzögerung aufgezeichnet wird.

Entfernen Sie unmittelbar vor dem Ablesen der Platte die Odorierungsplatte aus der Kammer. Geben Sie in die 96-Well-Platte, die die transfizierten Zellen enthält, 25 Mikroliter Odorant in den Raum zwischen den Wells und setzen Sie die Platte schnell wieder in die Kammer ein. Starten Sie die Lumineszenzmessung aller Wells für 20 Zyklen innerhalb von 30 Minuten.