Fluoreszenzlokalisation von Tight Junction Proteinen und Stressfasern in Endothelzellen

Nehmen Sie einen gekammerten Objektträger, der eine Monolayer-Kultur aus mikrovaskulären Endothelzellen (RBMECs) des Rattengehirns enthält, die die Endothelzellschicht der Blut-Hirn-Schranke nachahmen.

Die Zellen weisen gestörte Tight-Junction-Proteine und Aktin-Stressfasern auf, die auf Stress durch Sauerstoff-Glukose-Entzug gefolgt von Reoxygenierung

zurückzuführen sind.

Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen, tragen Sie ein Fixiermittel auf, um die Zellarchitektur zu erhalten, und waschen Sie dann überschüssiges Fixiermittel ab.

Mit einem Detergens behandeln, um die Zellmembranen zu permeabilisieren.

Inkubieren Sie mit einem Blockierungsmittel, um unspezifische Bindungsstellen zu maskieren.

Um Tight-Junction-Proteine zu markieren, inkubieren Sie mit spezifischen Primärantikörpern und entfernen Sie dann ungebundene Antikörper.

Inkubieren Sie mit Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpern, um die primären Antikörper zu markieren.

Alternativ können Sie zur Markierung der Stressfasern Fluorophor-markiertes Phalloidin hinzufügen.

Waschen, um ungebundene Markierungsmoleküle zu entfernen.

Entfernen Sie die Kammer, tragen Sie ein Einbettmedium mit einem fluoreszierenden DNA-bindenden Farbstoff auf, um die Zellkerne zu färben, und versiegeln Sie sie dann mit einem Deckglas.

Visualisieren Sie mit konfokaler Mikroskopie die fluoreszenzmarkierten Tight-Junction-Proteine und Stressfasern.

Beginnen Sie damit, jede Vertiefung der RBMEC-Monoschichten 100 bis 200 Mikrolitern Opti-MEM reduziertem Serummedium auszusetzen, und setzen Sie die Inkubation für eine Stunde fort. Waschen Sie dann die Objektträger dreimal mit 100 bis 200 Mikrolitern PBS pro Vertiefung und Waschgang. Fixieren Sie die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd in PBS und inkubieren Sie die Objektträger 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Und waschen Sie die Zellen wie zuvor dreimal mit PBS ab.

Permeabilisieren Sie nun die Zellen, indem Sie 100 bis 200 Mikroliter 0,5 % Triton X-100 in PBS auf jede Vertiefung auftragen. Und lassen Sie die Platte weitere 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nachdem die Zellen permeabilisiert wurden, tragen Sie die Blockierungslösung auf. Und lassen Sie dies eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf die Zellen einwirken.

Führen Sie als Nächstes entweder eine Immunfluoreszenz für das ZO-1-Protein durch oder markieren Sie F-Aktin. Um die Immunfluoreszenz der Zellen für ZO-1 durchzuführen, inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 Grad Celsius mit dem primären Antikörper. Waschen Sie die Zellen am nächsten Tag dreimal in PBS, z. B. beim Entfernen des Fixiermittels. Dann inkubieren Sie die Zellen eine Stunde lang bei Raumtemperatur in 100 bis 200 Mikrolitern FITC-Tag-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper, um die Zellen mit Rhodamin-Phalloidin zu markieren.

Nachdem Sie die Blockierungslösung eine Stunde lang aufgetragen haben, setzen Sie die Zellen 20 Minuten lang 100 bis 200 Mikroliter Rhodamin-Phalloidin in einer Verdünnung von 1 bis 50 mit 2 % BSA PBS aus. Nach der Inkubation des Sekundärantikörpers oder des Rhodamin-Phalloidins waschen Sie die Zellen wie zuvor dreimal mit PBS. Entfernen Sie dann die Kammern, indem Sie das Gummiband abziehen. Fahren Sie mit der Montage der Dias fort, wobei Sie ein Medium verwenden, das Antifading und DAPI enthält. Bilden Sie die Zellen mit konfokaler Mikroskopie in einer einzigen Ebene mit einem 60-fachen Objektiv ab.