JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Neurowissenschaften
0 Aufrufe • 4:15 Min. • April 28th, 2025
Nehmen Sie einen gekammerten Objektträger, der eine Monolayer-Kultur aus mikrovaskulären Endothelzellen (RBMECs) des Rattengehirns enthält, die die Endothelzellschicht der Blut-Hirn-Schranke nachahmen.
Die Zellen weisen gestörte Tight-Junction-Proteine und Aktin-Stressfasern auf, die auf Stress durch Sauerstoff-Glukose-Entzug gefolgt von Reoxygenierung
zurückzuführen sind.Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen, tragen Sie ein Fixiermittel auf, um die Zellarchitektur zu erhalten, und waschen Sie dann überschüssiges Fixiermittel ab.
Mit einem Detergens behandeln, um die Zellmembranen zu permeabilisieren.
Inkubieren Sie mit einem Blockierungsmittel, um unspezifische Bindungsstellen zu maskieren.
Um Tight-Junction-Proteine zu markieren, inkubieren Sie mit spezifischen Primärantikörpern und entfernen Sie dann ungebundene Antikörper.
Inkubieren Sie mit Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpern, um die primären Antikörper zu markieren.
Alternativ können Sie zur Markierung der Stressfasern Fluorophor-markiertes Phalloidin hinzufügen.
Waschen, um ungebundene Markierungsmoleküle zu entfernen.
Entfernen Sie die Kammer, tragen Sie ein Einbettmedium mit einem fluoreszierenden DNA-binden
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