$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Beginnen Sie mit einem chemisch fixierten Gehirnschnitt von nicht-menschlichen Primaten.
Das Fixiermittel auf Aldehydbasis vernetzt Proteine, wobei die Gewebestruktur erhalten bleibt, aber einige reaktive Aldehydrückstände zurückbleiben.
Waschen, um die Kryoprotektivschicht zu entfernen, die den Gewebeabschnitt umgibt.
Fügen Sie ein Reduktionsmittel hinzu, um die reaktiven Aldehydgruppen zu neutralisieren und Reaktionsnebenprodukte zu erzeugen.
Waschen, um diese Nebenprodukte und überschüssige Reduktionsmittel zu entfernen.
Tragen Sie eine Blockierungslösung auf, um eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern.
Fügen Sie primäre Antikörper hinzu, die auf ein Protein abzielen, das an bestimmten Stellen auf der neuronalen Membran exprimiert wird.
Waschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen.
Biotinylierte Sekundärantikörper zugeben, die auf die Primärantikörper abzielen,
waschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen.
Mit Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplexen, die an die Sekundärantikörper binden, überlagert und
erneut waschen, um ungebundene Komplexe zu entfernen.
Führen Sie ein chromogenes Substrat zusammen mit Wasserstoffperoxid ein. In Gegenwart von Wasserstoffperoxid oxidiert das Peroxidase-Enzym das Substrat und bildet braune Ausfällungen.
Beginnen Sie mit der Übertragung von 50 Mikrometer dicken Abschnitten von Acrolein-fixierten nicht-menschlichen Primatengehirnen, die die interessierende Region enthalten, auf eine 12-Well-Platte, die PBS enthält. Waschen Sie die frei schwimmenden Abschnitte dreimal fünf Minuten lang bei Raumtemperatur in PBS. Anschließend werden die Schnitte in frisch zubereiteter Natriumborhydridlösung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Sanft schaukeln ohne Abdeckung.
Sobald die 30 Minuten abgelaufen sind, aspirieren Sie das Natriumborhydrid und fügen Sie PBS zu jeder Vertiefung hinzu. Den Teller auf eine Wippe legen und 10 Minuten kräftig schütteln. Wiederholen Sie den Waschgang noch zwei Mal oder bis kein Reaktionsgas mehr übrig ist. Blockieren Sie die Schnitte, indem Sie in einer Lösung aus 2 % normalem Serum und 0,5 % kalter Fischgelatine, verdünnt in PBS, eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schaukeln inkubieren.
Nach Ablauf der Inkubationszeit werden die Schnitte und die Primärantikörperlösung unter leichtem Schaukeln über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Am nächsten Tag, nachdem Sie die Schnitte wie zuvor gewaschen haben, inkubieren Sie die Schnitte 1,5 Stunden lang bei Raumtemperatur bei Raumtemperatur unter leichtem Schaukeln. Nach dem Waschen der Schnitte wie zuvor eine Stunde lang in Avidin Biotin Peroxidase oder ABC-Lösung unter Schaukeln inkubieren.
Als nächstes bereiten Sie eine frische Lösung aus 0,05 % 3,3-Diaminobenzidin mit 0,005 % Wasserstoffperoxid in TBS verdünnt vor. Nach dem Waschen die Abschnitte drei bis sieben Minuten lang in der DAB-Lösung unter leichtem Schaukeln inkubieren. Sobald sich der braune Niederschlag zu der gewünschten Farbe entwickelt hat, stoppen Sie die Reaktion, indem Sie ihn schnell zweimal in kalter TBS waschen und dann eine Reihe von zeitgesteuerten TBS- und PB-Wäschen durchführen.