Immunhistochemische Färbung von Biomarkern in Hirntumor-Neurosphärenschnitten

Nehmen Sie eine Folie mit paraffineingebetteten Schnitten von Hirntumor-Neurosphären, Clustern von neuralen Stammzellen, die tumorspezifische nukleäre Protein-Biomarker aufweisen.

Erhitzen Sie, um Paraffin zu schmelzen, entfernen Sie es mit Xylol und rehydrieren Sie das Gewebe mit abnehmenden Alkoholkonzentrationen.

Erhitzen Sie in einem sauren Puffer, der Detergens enthält, um Epitope auf den Biomarkern zu demaskieren und Zellmembranen zu permeabilisieren.

Spülen und dann mit einem Oxidationsmittel behandeln, um endogene Peroxidase-Enzyme zu inaktivieren und unspezifische Signale zu verhindern.

Wenden Sie eine Blockierungslösung an, um unspezifische Bindungsstellen zu maskieren.

Inkubieren Sie mit primären Antikörpern, die auf die Biomarker-Epitope abzielen.

Spülen und dann mit Biotin-konjugierten Sekundärantikörpern behandeln, die an die Primärantikörper binden.

Spülen und inkubieren mit einem Peroxidase-Enzym-konjugierten Avidin, das an Biotin bindet.

Fügen Sie ein chromogenes Substrat und ein Oxidationsmittel hinzu.

Peroxidase verwendet das Mittel, um das Substrat in farbige Ausfällungen umzuwandeln und die Position des Biomarkers zu markieren.

Färben Sie die Zellkerne gegen, dehydrieren Sie das Gewebe in Alkohol und montieren Sie den Objektträger für die Abbildung der Biomarker-Verteilung.

Zuerst schmelzen Sie das Paraffin, indem Sie die Objektträger in einem Metallgestell bei 60 Grad Celsius 20 Minuten lang inkubieren. Anschließend wurden die Objektträger durch Inkubation in einem Rehydratisierungszug bei Raumtemperatur gemäß dem Tex-Protokoll entparaffiniert. Lagern Sie die Objektträger in Leitungswasser, um eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern. Danach inkubieren Sie die Objektträger 30 Sekunden lang in Citratpuffer bei 125 Grad Celsius und 10 Sekunden lang bei 90 Grad Celsius. Lassen Sie die Objektträger abkühlen, bevor Sie sie fünfmal mit destilliertem Wasser abspülen.

Als nächstes inkubieren Sie die Objektträger bei Raumtemperatur in 0,3 % Wasserstoffperoxid für 20 Minuten. Waschen Sie die Objektträger dann dreimal fünf Minuten lang in Waschpuffer unter leichtem Rühren. Inkubieren Sie die Objektträger über Nacht in einer befeuchteten Kammer bei 4 Grad Celsius mit verdünntem Primärantikörper. Waschen Sie die Objektträger danach dreimal fünf Minuten lang unter leichtem Rühren.

Als nächstes inkubieren Sie die Objektträger in verdünnten biotinylierten Sekundärantikörpern bei Raumtemperatur für eine Stunde. Waschen Sie die Objektträger dreimal fünf Minuten lang in einem Waschpuffer unter leichtem Rühren. Inkubieren Sie dann die Objektträger in einem biotinylierten Meerrettichperoxidase-Komplex bei Raumtemperatur im Dunkeln für eine Stunde. Wiederholen Sie den Waschgang wie zuvor beschrieben. Danach werden die Objektträger zwei bis fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit Tupfwasserstoffperoxid-Substratbändern inkubiert.

Spülen Sie die Objektträger mit Leitungswasser ab und tauchen Sie die Objektträger in Hämatoxylinlösung, um sie zu verfärben. Spülen Sie die Rutschen dann gründlich mit Leitungswasser ab, bis das Wasser klar ist. Dehydrieren Sie die Objektträger gemäß dem Tex-Protokoll. Zum Schluss überziehen Sie die Objektträger mit einem Eindeckmedium auf Xylolbasis und lassen Sie sie auf einer ebenen Fläche bei Raumtemperatur trocknen.