Name: Herstellung viraler DNA aus Nukleokapside (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 45 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung hochreiner Herpesvirus-Nukleokapsid-DNA aus infizierten Zellen mittels Ultrazentrifugation und Phenol-Chloroform-Extraktion. Diese Methode liefert DNA in hoher Konzentration und Reinheit für Sequenzierung und Transfektionen.

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Die Autoren schätzen die Beiträge Greg Smith, Lisa Pomeranz, Matt Lyman, Marlies Eldridge, Halina Staniszewska Goraczniak, und die Mitglieder des Enquist Labor in die Feinabstimmung dieses Protokoll.

1. Erster Tag: Virusinfektion und Herstellung der Puffer <ol><li> Bereiten 5-10 Gerichte (15 cm Durchmesser) Gewebekulturzellen für eine Infektion, simplex zB PK-15-Zellen für Pseudorabiesvirus (PRV) oder Vero-Zellen für Herpes-Virus (HSV). </li><li> Wenn die Zellen 95 sind - 100% konfluent, infizieren sie zu einem (MOI) von 5-10. Um dies zu tun, impfen jede Platte mit Viren Lager in einem Gesamtvolumen von 4 ml pro Platte, dann inkubieren die Platten für 1 Stunde bei 37 ° C. Rock-Platten sanft alle 15 Minuten, um sicherzustellen, dass die Zellmonolayer vollständig beschichtet mit dem Virus Inokulum bleibt. In der Zwischenzeit, warm das Medium für den nächsten Schritt. </li><li> Nach einer Stunde der Infektion, absaugen viralen Inokulum von den Platten, 15 ml warmes Medium und Inkubation bei 37 ° C für 12-20 Stunden in einem befeuchteten Inkubator. </li><li> Bereiten LCM-Puffer (siehe Tabelle 1) und Rock-Nacht bei 4 ° C für eine gute Durchmischung. Bereiten TNE zur Resuspension der viralen DNA (siehe Tabelle 2). </li></ol> 2. Zweiter Tag, Phase 1: Cell Lysis und Ultrazentrifugation <ol><li> Visuell, dass die Infektion der Zellen hat einheitliche zytopathischen Effekts (CPE) verursacht. Lassen Infektion, um die Fortschritte, bis alle Zellen aufgerundet haben, aber noch nicht von der Platte gehoben. </li><li> Kratzen Sie die infizierten Zellen in das Medium, und kombinieren Zellen und Medium in 50 ml konische Röhrchen. Die Zahl der konischen Rohren für diesen Schritt benötigt wird von der Anzahl der Gerichte für eine Infektion in Schritt 1.2 oben abhängen, kann z. B. ein 50 ml konischen Rohr zu Pellets verwendet werden maximal 3 Gerichte von 15 ml Medium je Optional:. Spülen Platten mit 10 ml PBS und mit den Zellen und Medium zu verbinden. </li><li> Centrifuge Zellen und Medium für 10 Minuten bei 2000 relativ centifugal (RZB) bei Raumtemperatur, dann absaugen Überstand und resuspendieren jedes Pellet in 10 ml PBS. Wenn die Pellets aus einer Virusinfektion in mehrere konische Röhrchen in Schritt 2.2 verteilt wurde, können diese in einem konischen Rohr bei diesem Schritt wieder zusammengeführt werden. Wiederholen Sie die Zentrifugation und Aspiration. Optional: Das Pellet kann bei -20 ° C gelagert werden und das Protokoll weiter zu einem späteren Zeitpunkt. </li></ol> 3. Zweiter Tag, Phase 2: Ultrazentrifugation Halten Sie das Zellpellet und LCM-Puffer auf Eis, wenn möglich während der folgenden Schritte. <ol><li> Add β-Mercaptoethanol auf 0% Glycerin - LCM-Puffer. Begin Kühlung der Ultrazentrifuge (für Schritt 3,9 unten), indem Sie sie auf 4 ° C und das Einschalten des Vakuums. </li><li> Zellpellet in 5 ml von 0% Glycerin - LCM-Puffer, bis es nicht mehr klumpig. Wenn nötig, Wirbel das Rohr zu brechen alle ungelösten Zellpellet. </li><li> Auszug durch Zugabe von 1,5 ml Freon (1,1,2-Trichlor-1 ,2,2-trifluorethan) und Vortex kräftig. Sofort für 10 min bei 2000 rcf zentrifugiert bei einer Temperatur von 4 ° C. Sammeln Sie die obere Schicht mit einem breiten Bohrung Pipettenspitze (Vermeidung der Schnittstelle) und Transfer in ein neues Röhrchen Optional:. Wenn das Pellet einer gallertartigen solide, können Sie schnell gießen Sie die obere Schicht in ein neues Röhrchen. </li><li> Wiederholen Sie die Freon-Extraktion und Zentrifuge wieder. </li><li> Sammeln Sie die obere Schicht (~ 5 ml) und an einem neuen Polyallomer Ultrazentrifuge Röhre. Add β-Mercaptoethanol auf die beiden verbleibenden Glycerin - LCM-Puffer. </li><li> Bereiten Sie einen Gradienten in der Polyallomer Zentrifugenröhrchen durch Unterlegen der Freon-Extrakt (oberste Schicht) mit 3 ml 5% Glycerin - LCM (Mittelschicht) und dann wieder Unterlegen mit 2,5 ml 45% Glycerin - LCM (untere Schicht). Verwenden Sie einen dünnen Pipette zum Überlaufen des Rohres Inhalte zu verhindern. </li><li> Falls erforderlich, bereiten eine entsprechende Balance Rohr mit den gleichen Anteilen von LCM-Puffer. </li><li> Transfer-Rohre in Ultrazentrifuge Eimer. Balance-Eimern bis zu 0,1 g voneinander, durch vorsichtiges Hinzufügen zusätzlicher 0% Glycerin - LCM-Puffer, um die oberste Schicht (~ 50-100 ul zu einem Zeitpunkt). </li><li> Mit einem kalten Ultrazentrifuge mit einer horizontalen oder Ausschwingrotor, drehen Sie das ausgewogene Proben für 1 Stunde bei 77.000 rcf (z. B. 25.000 UpM für eine SW41Ti Rotor) bei einer Temperatur von 4 ° C. </li><li> Während Ultrazentrifugation, um ein Glas Haken schwimmenden DNA bei der Ethanol-Fällung (4,6 unten) zu erfassen. Halten Sie beide Enden ein Glas Pasteur-Pipette sowie die Aussetzung der mittlere Abschnitt über einer Flamme. Wenn ein Abschnitt des Glases fast geschmolzen ist, ziehen Sie vorsichtig auf das Glas strecken, biegen Sie es vorsichtig, um eine eng abgewinkelten Haken (&lt;90 Grad) zu erstellen, und ziehen Sie kräftig zu versiegeln Ende. Wenn die Spitze des Glases Haken offen ist, halten Sie die Spitze über der Flamme, so dass das Glas schmilzt genug, um es zu schließen. </li><li> Nach der Ultrazentrifugation, sollten Sie eine dünne opake Pellet mit einem dunklen Fleck in der Mitte zu sehen. Vorsichtig absaugen der Flüssigkeit aus dem Rohr, einschließlich Schmalz an den Seiten, aber unter Vermeidung der Pellet am Boden des Röhrchens. </li><li> 0,5 ml TNE bei Raumtemperatur. </li><li> Lassen Sie das Pellet für mindestens 10 Minuten lang Hydratation des Pellets zu ermöglichen. Optional: Das Pellet kann auch in TNE Nacht resuspendieren, wenn bei 4 ° C gehalten </li></ol> 4. Dritter Tag: "Ghost" DNA Niederschlag <ol><li> Break up das Pellet durch Pipettieren mit einer kleinkalibrigen Pipettenspitze (zB p200 Pipettenspitze). Mach dir keine Sorgen Scheren bei diesem Schritt, da die virale DNA ist noch in Kapside an dieser Stelle enthalten. Fügen Sie die folgenden Reagenzien auf das Röhrchen mit dem viralen Pellet bei Raumtemperatur, um Kapside zu zerstören: <ul><li> 4,25 ml TNE </li><li> 0,25 ml 10% SDS </li><li> 2 mg Proteinase K </li></ul> Schütteln Sie diese Reagenzien zu mischen. Es sollte ein leichter Anstieg der Viskosität. </li></ol> Hüten Sie sich vor Scheren von hier aus, z. B. die Verwendung großer Bohrung Pipetten und nicht vortexen der viralen Material <ol start="2"><li> Auszug viraler Proteine ​​durch Zugabe von 5 ml Phenol-Chloroform und beginnt sofort mit Invertieren oder Vortexen, um eine Emulsion zu erhalten. Mix für 10 Sekunden, dann Zentrifuge die Emulsion für 5 Minuten bei 2000 rcf bei Raumtemperatur. Sammeln Sie die obere Schicht mit einem breiten Bohrung Pipettenspitze, die Vermeidung der Schnittstelle und die Übertragung in ein neues Röhrchen Optional:. Verwenden Phase Lock Gel (PLG) Rohre in diesem Schritt, um eine Verunreinigung von der Oberfläche zu vermeiden. </li><li> Wiederholen Sie die Phenol-Chloroform-Extraktion und Zentrifuge wieder. </li><li> Nach dem zweiten Phenol-Chloroform-Extraktion, sammeln die oberste Schicht in eine 30 ml Glas Corex Röhrchen und Chill das Rohr bei -20 ° C für 10-15 Minuten, wobei darauf geachtet, dass sie nicht einfrieren. </li><li> 10 ml eiskaltem Ethanol, decken das Rohr (z. B. durch Recken ein Stück Parafilm M over the top) und invertieren, um sofort zu mischen. Achten Sie auf eine DNA "Geist" zu erscheinen, die aus einer dünnen klebrigen Niederschlag besteht. Das Röhrchen vorsichtig weiter vermischen und verursachen den klebrigen DNA ausfällt, um die Cluster zusammen. </li><li> Verwenden Sie ein Glas Haken, um die DNA ghost (s) zu erfassen. Sorgfältig Blot die DNA, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, dann setzen Sie den Haken (Spitze nach unten) in ein 1,5 ml-Tube und trocknen lassen. Add 0,25 bis 0,5 ml TE, um die DNA Geist aufzulösen. Lassen Resuspension der DNA für mindestens 1 Stunde vor. DNA bei 4 ° C. Optional: Um DNA-Ausbeute zu maximieren, brechen das Glas Haken in die 1,5-ml-Tube kann, so dass Resuspension von der Glassplitter im Laufe der Zeit weiter. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Bei einer ausreichend hohen MOI, sollten die Zellen vollständig CPE innerhalb von ~ 18 Stunden nach der Infektion (HPI) zu erreichen für Wildtyp-PRV-Stämme, und ~ 24 hpi für Wildtyp-HSV-1-Stämme (Abbildung 1). Sobald das infizierte Zellpellet geerntet wird, können die verbleibenden Schritte-Protokoll vollständig in einem langen Tag oder sich über zwei Tage (Abbildung 2). Bei der Vorbereitung Glas Haken an der DNA Geist zu erfassen, ist es wichtig, den Haken Winkel weniger als 90 Grad, so dass sie später in die Basis eines 1,5-ml-Tube (Abbildung 3) passen. Die Abdichtung der Spitze dieses Hakens verhindert DNA-Verlust in der Pipette. DNA Geister Form bei der Fällung und wird als weiße, zähe Fäden (Abb. 4) erscheinen. Diese aggregieren und kleben aneinander und / oder das Glas Haken benutzt, um die DNA zu erfassen. So das gleiche Glas Haken kann verwendet werden, um aufzusammeln mehrere Threads von DNA aus dem Niederschlag Lösung sein. <table border="1"><tbody><tr><td> Wählen Sie Spalte auf das gewünschte Volumen: </td><td> 10 ml </td><td> 15 ml </td><td> 20 ml </td><td> 40 ml </td></tr><tr><td> 1M KCL </td><td> 1,3 ml </td><td> 1,9 ml </td><td> 2,5 ml </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 1M Tris (pH 7,4) </td><td> 300 pl </td><td> 450 ul </td><td> 600 ul </td><td> 1,2 ml </td></tr><tr><td> 1M MgCl 2 </td><td> 50 pl </td><td> 75 ul </td><td> 100 ul </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> 0,5 EDTA </td><td> 10 pl </td><td> 15 ul </td><td> 20 pl </td><td> 40 ul </td></tr><tr><td> NP40/IGEPAL </td><td> 50 pl </td><td> 75 ul </td><td> 100 ul </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol (unmittelbar vor Gebrauch hinzugefügt) </td><td> 4,3 ul </td><td> 6,5 ul </td><td> 8,6 ul </td><td> 17,2 ul </td></tr><tr><td colspan="5"></td></tr><tr><td colspan="5"> Verwenden Anteile für gewünschte Prozent Glycerin (0, 5 oder 45%) </td></tr><tr><td> 0% Glycerin </td><td> Keiner </td><td> Keiner </td><td> Keiner </td><td> Keiner </td></tr><tr><td> Wasser </td><td> 8,3 ml </td><td> 12,5 ml </td><td> 16,7 ml </td><td> 33,4 ml </td></tr><tr><td> 5% Glycerin </td><td> 0,5 ml </td><td> 0,8 ml </td><td> 1,0 ml </td><td> 2,0 ml </td></tr><tr><td> Wasser </td><td> 7,8 ml </td><td> 11,7 ml </td><td> 15,7 ml </td><td> 31,4 ml </td></tr><tr><td> 45% glycerol </td><td> 4,5 ml </td><td> 6,8 ml </td><td> 9,0 ml </td><td> 18,0 ml </td></tr><tr><td> Wasser </td><td> 3,8 ml </td><td> 5,7 ml </td><td> 7,7 ml </td><td> 15,4 ml </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Rezepte für die Zubereitung von LCM-Puffer <table border="1"><tbody><tr><td> Für 50 ml Volumen </td></tr><tr><td> 5 ml 1M NaCl </td></tr><tr><td> 2,5 ml 1M Tris, pH 7,5 </td></tr><tr><td> 1 ml 0,5 EDTA </td></tr><tr><td> 41,5 ml H 2 O </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Vorbereitung der TNE (0,1 M NaCl, 50 mM Tris, pH 7,5, 10 mM EDTA) <table border="1"><tbody><tr><td> Für 1 Liter </td></tr><tr><td> 0,2 g KCl </td></tr><tr><td> 0,2 g KH 2 PO 4 </td></tr><tr><td> 8 g NaCl </td></tr><tr><td> 1,15 g Na 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> H 2 O auf 1L </td></tr></tbody></table> Tabelle 3. Herstellung des PBS (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4, 137 mM NaCl und 8,1 mM Na 2 HPO 4, pH 7,0) <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. PK15-Zellen (A) vor der Infektion, (B) auf halbem Wege durch Infektion und (C) auf zytopathischen Effekt (CPE), nachdem eine hohe Multiplizität der Infektion. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Überblick über das Protokoll. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Drei repräsentative Beispiele aus Glas Haken benutzt, um die virale DNA Geister zu sammeln. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Repräsentatives Beispiel für eine wohlgeformte und reichlich DNA "Geist".

<ol><li>Szpara, M. L., Parsons, L., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+variability+in+clinical+and+laboratory+isolates+of+herpes+simplex+virus+1+reveals+new+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations.</a> J Virol. 84, 5303-5313 (2010).</li>
<li>Banfield, B. W., Kaufman, J. D., Randall, J. A., Pickard, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+pseudorabies+virus+strains+expressing+red+fluorescent+proteins%3A+new+tools+for+multisynaptic+labeling+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development of pseudorabies virus strains expressing red fluorescent proteins: new tools for multisynaptic labeling applications.</a> J Virol. 77, 10106-10112 (2003).</li>
<li>Kobiler, O., Lipman, Y., Therkelsen, K., Daubechies, I., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpesviruses+carrying+a+Brainbow+cassette+reveal+replication+and+expression+of+limited+numbers+of+incoming+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Herpesviruses carrying a Brainbow cassette reveal replication and expression of limited numbers of incoming genomes.</a> Nat Commun. 1, 146-146 (2010).</li>
<li>Enquist, L. W., Madden, M. J., Schiop-Stanley, P., Vande Woude, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+herpes+simplex+type+1+DNA+fragments+in+a+bacteriophage+lambda+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cloning of herpes simplex type 1 DNA fragments in a bacteriophage lambda vector.</a> Science. 203, 541-544 (1979).</li>
<li>Smith, G. A., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+transposon+mutagenesis+in+Escherichia+coli+of+a+full-length+infectious+clone+of+pseudorabies+virus%2C+an+alphaherpesvirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Construction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-length infectious clone of pseudorabies virus, an alphaherpesvirus.</a> J Virol. 73, 6405-6414 (1999).</li>
<li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFlint%2C+SJ+%22Principles+of+virology%22">Principles of virology</a>. , 3rd edn, ASM Press. (2008).</li>
<li>Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+pseudorabies+virus%3A+impact+on+neurovirology+and+veterinary+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 69, 462-500 (2005).</li>
<li>Roizman, B., Pellett, P. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoizman%2C+B+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. , 2 ed, Lippincott Williams & Wilkins. 2381-2397 (2001).</li>
<li>Mendez, I. I., Hermann, L. L., Hazelton, P. R., Coombs, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+analysis+of+freon+substitutes+in+the+purification+of+reovirus+and+calicivirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A comparative analysis of freon substitutes in the purification of reovirus and calicivirus.</a> J Virol Methods. 90, 59-67 (2000).</li>
<li>Gharabaghi, F., Aymard, M., Trotemann, P., Gerdil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+simplified+micromethod+for+subtyping+varicella-zoster+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">A rapid and simplified micromethod for subtyping varicella-zoster virus.</a> J Med Virol. 31, 129-134 (1990).</li>
<li>Granstedt, A. E., Szpara, M. L., Kuhn, B., Wang, S. S., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+monitoring+of+in+vivo+neural+activity+using+a+circuit-tracing+pseudorabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based monitoring of in vivo neural activity using a circuit-tracing pseudorabies virus.</a> PLoS One. 4, e6923-e6923 (2009).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Teile dieses Protokoll wurden ursprünglich für die virale DNA-Isolierung in BSL4 Bedingungen entwickelt, aber es passt ebenso gut auf nicht-BSL Bedingungen. 4 Wir verwenden häufig dieses Protokoll, um DNA aus den Alpha-Herpesviren PRV und HSV-1, das DNA-Genome sind zu isolieren eingeschlossen in einem proteinhaltigen Kapsid, umgeben von einer Lipid-Hülle. 7,8 Jedoch ist es wahrscheinlich, direkt anpassungsfähig zu anderen großen DNA-Viren, wie zB Beta-und Gamma-Herpesviren und Adenoviren. Ähnliche ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Freon (1,1,2-Trichlor-1 ,2,2-trifluorethan) </td><td> Fischer </td><td> T178-4 </td><td> Erkundigen Sie sich bei Ihrer Institution Richtlinien zur angemessenen Entsorgung von Freon-haltigen Abfällen, oder sehen Sie Mendez et al. für potenzielle Freon Alternativen. 9 </td></tr><tr><td> Phase Lock Gel Röhrchen, Heavy 15ml Kapazität </td><td> 5 PRIME </td><td> 2302850 </td><td> Fakultativ </td></tr><tr><td> Polyallomer Ultrazentrifuge Rohre </td><td> Beckman * </td><td> 331372 * </td><td> * Wählen Sie Röhren für Ihre eigenen Ultrazentrifuge, diese sind nur als Beispiel enthalten </td></tr><tr><td> NP-40 / IGEPAL </td><td> Sigma </td><td> I-3021 </td><td></td></tr><tr><td> PK-15-Zellen </td><td> ATCC </td><td> CCL-33 </td><td></td></tr><tr><td> Vero-Zellen </td><td> ATCC </td><td> CCL-81 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> HyClone </td><td> SH30028.03 </td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung viraler dna aus nukleokapside

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Viren sind obligate Parasiten zellulären und damit die Untersuchung ihrer DNA erfordert Isolierung viraler Material vom Wirtszelle Verunreinigungen und DNA. Mehrere nachgelagerten Anwendungen erfordern große Mengen an reiner viraler DNA, die durch dieses Protokoll vorgesehen ist. Zu diesen Anwendungen zählen virale Genom-Sequenzierung, in denen die Beseitigung der Wirts-DNA ist entscheidend für die Datenausgabe für virale Sequenzen zu optimieren und die Produktion neuer viraler rekombinanten Stämmen, wo Co-Transfektion von gereinigter Plasmid-und lineare virale DNA erleichtert Rekombination. 1,2, 3 Dieses Verfahren verwendet eine Kombination von Extraktionen und Dichte-basierte Zentrifugieren zu isolieren gereinigten linearen Herpesvirus Nukleokapsid DNA aus infizierten Zellen. 4,5 Die ersten Reinigungsschritte Ziel gereinigten viralen Kapside zu isolieren, die enthalten und schützen die virale DNA während der Extraktion und Zentrifugationsschritte dass zelluläre Proteine ​​und DNA zu entfernen. Lysis von Nukleokapside gibt dann die virale DNA, und zwei abschließende Phenol-Chloroform Schritte entfernen verbleibenden Proteine. Die endgültige DNA aus der Lösung erfasst ist hoch konzentriert und rein, mit einer durchschnittlichen OD 260/280 von 1,90. Je nach der Menge der infizierten Zellen verwendet, die Erträge der viralen DNA-Bereich von 150 bis 800 ug oder mehr. Die Reinheit dieser DNA macht es stabil während der Langzeit-Lagerung bei 4C. Diese DNA ist somit ideal für Hochdurchsatz-Sequenzierung, high fidelity PCR-Reaktionen, und Transfektionen geeignet. Vor Beginn des Protokolls, ist es wichtig, die durchschnittliche Anzahl der Zellen pro Schale (z. B. durchschnittlich 8 x 10 6 PK-15-Zellen in einer konfluenten 15 cm Schale), und der Titer der viralen Lager verwendet werden wissen ( zB 1 x 10 8 Plaque-bildenden Einheiten pro ml). Diese sind notwendig, um die entsprechende Multiplizität der Infektion (MOI) für das Protokoll zu berechnen. 6 Zum Beispiel, um eine 15 cm Schüssel mit PK-15-Zellen mit den oben genannten viralen Lager, bei einer MOI von 5 infiziert, würden Sie 400 ul viralen Lager und verdünnen Sie es mit 3,6 ml Medium (insgesamt Impfung Volumen von 4 ml für eine 15 cm-Platte). Mehrere virale DNA-Präparate können zur gleichen Zeit vorbereitet werden. Die Anzahl der gleichzeitigen Vorbereitung ist nur durch die Anzahl der Rohre durch die Ultrazentrifuge Rotor statt Limited (einer pro-Virus; siehe Schritt 3,9 unten). Hier beschreiben wir das Verfahren, als ob die für einen Virus getan.

Wir beschreiben den Prozess der Isolierung hochreiner Herpesvirus Nukleokapsid DNA aus infizierten Zellen. Die endgültige DNA aus der Lösung erfasst ist von hoher Konzentration und Reinheit und ist damit ideal für Hochdurchsatz-Sequenzierung, high fidelity PCR-Reaktionen, und Transfektionen neue virale Rekombinanten produzieren geeignet.

Herstellung viraler DNA aus Nukleokapside

Viren sind obligate Zellparasiten, weshalb die Untersuchung ihrer DNA die Isolierung des viralen Materials von Kontaminanten und der DNA der Wirtszelle erfordert. ...

Dieses Video demonstriert ein Verfahren zur Isolierung von hochreinen viralen Nukleokapsiden und DNA aus infizierten Zellen. Zunächst werden lipidhaltige Membranen durch eine zweifache Gefriertrocknung während der Extraktion denaturiert. Anschließend wird die Probe ultrazentrifugiert, um die viralen Nukleokapside als Pellet abzutrennen und sie von leichteren zellulären und viralen Bestandteilen zu separieren.Es werden Detergenzien und Proteinase K hinzugefügt, um die virale DNA aus den pelletierten Nukleokapsiden freizusetzen. Anschließend werden zwei Phenol-Chloroform-Extraktionen durchgeführt, um alle verbleibenden Proteine zu entfernen. Schließlich wird die virale DNA in Lösung ausgefällt.Letztlich zeigen die Ergebnisse, dass aus diesen infizierten Zellen hochkonzentrierte und reine virale DNA isoliert wurde. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden, die keine Freisetzung ungebundener Extrakte oder Ultrazentrifugation beinhalten, liegt darin, dass die hier erzeugte virale DNA nur sehr geringe Mengen an Wirtszell-DNA-Verunreinigungen aufweist und sich somit ideal für nachgeschaltete Verfahren wie PCR und die Tiefe Sequenzierung viraler Genome eignet. Wir verwendeten diese Methode erstmals zu Beginn der Arbeiten mit rekombinanter DNA, als besondere Vorsichtsmaßnahmen von großer Bedeutung waren.Wir haben dieses Verfahren zur Isolierung viraler DNA entwickelt, während wir unter BSL-4-Bedingungen in einem Handschuhkasten arbeiteten. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Bildung des Gradienten und die DNA-Ghosting-Schritte schwer zu erlernen sind. Dies liegt daran, dass das Schichten des Gradienten eine äußerst ruhige Hand erfordert und das in Lösung ausfallende DNA-Ghost schwer zu erkennen ist, wenn man keine Vorerfahrung in dessen Identifizierung hat.Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie fünf bis zehn Petrischalen mit einem Durchmesser von 15 Zentimetern mit Gewebekulturzellen für die Infektion vorbereiten. Hier werden PK-15-Zellen für die Infektion mit Pseudorabies-Virus vorbereitet, wenn die Zellen zu 95 bis 100 % konfluent sind. Ersetzen Sie das Medium durch vier Milliliter Medium, das das Virus enthält. Bei einer MOI von fünf bis zehn inkubieren Sie die Platten eine Stunde lang in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2, wobei alle 15 Minuten geschüttelt wird.Bewegen Sie die Platten vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Zellmonolayer vollständig mit dem Virusinokulum bedeckt bleibt. Während der Inkubation erwärmen Sie das Medium für den nächsten Schritt. Nach einer Stunde Infektion saugen Sie das Virusinokulum von den Platten ab.Dann 15 Milliliter warmes Medium hinzufügen und 12 bis 20 Stunden bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator inkubieren. Schließlich, zur Vorbereitung auf die Experimente des nächsten Tages, eine frische Charge LCM- und TNE-Puffer herstellen. Beachten Sie, dass die Zugabe von NP-40 zur Bildung von Bändern in der Akquis-Lösung führt.Die vorbereiteten Lösungen über Nacht auf einem Schüttler bei vier Grad Celsius stehen lassen. Am nächsten Tag sollten sich die Lösungen vollständig integriert haben. Die Petrischale auf den Objekttisch eines zusammengesetzten Mikroskops stellen und visuell bestätigen, dass die Infektion der Zellen eine einheitliche zytopathische Wirkung verursacht hat.Alle Zellen sollten sich aufgerundet haben, sich jedoch noch nicht von der Platte gelöst haben. Falls die Zellen sich noch nicht aufgerundet haben, fahren Sie mit der Inkubation fort, bis zytopathische Effekte beobachtet werden. Anschließend schaben Sie die infizierten Zellen in das Medium und sammeln die Zellen im Medium in kegelförmigen 50-Milliliter-Röhrchen, um die Ausbeute zu erhöhen.Spülen Sie die Platten mit 10 Milliliter PBS und kombinieren Sie sie mit den Zellen in Medium. Zentrifugieren Sie anschließend Zellen und Medium 10 Minuten lang bei 2000 RCF bei Raumtemperatur, um verbleibendes Medium und Serum zu entfernen. Aspirieren Sie das Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 10 Milliliter PBS. Wiederholen Sie die Zentrifugation und die Aspiration. Falls das Experiment nicht am selben Tag fortgesetzt wird, bewahren Sie das Pellet bei minus 20 Grad Celsius auf, bis es für die in diesem Abschnitt gezeigten Schritte verwendet wird.Es ist wichtig, das Zellpellet und die LCM-Puffer stets möglichst auf Eis zu lagern. Bereiten Sie die Ultrazentrifugation vor, indem Sie Beamer capto Ethanol dem 0% Glycerol LCM-Puffer hinzufügen, sodass die Endkonzentration von Beamer capto Ethanol 0,043 % beträgt. Bereiten Sie außerdem die Ultrazentrifuge vor, indem Sie sie auf vier Grad Celsius einstellen und das Vakuum einschalten, während die Ultrazentrifuge abkühlt. Geben Sie fünf Milliliter des 0 % Glycerol LCM-Puffers mit 0,043 % Beamer capto Ethanol zum Zellpellet hinzu und pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um das Pellet erneut in Suspension zu bringen.Zerlegen Sie gegebenenfalls alle Klumpen vollständig. Wirbeln Sie das Röhrchen, um eventuelle ungelöste Zellpellets aufzulösen. Geben Sie als Nächstes 1,5 Milliliter hinzu, um die zellulären und viralen Membranen zu extrahieren.Schütteln Sie das Freon sofort kräftig in einem Vortex. Zentrifugieren Sie 10 Minuten bei 2000 RCF und vier Grad Celsius. Nach dem Zentrifugieren bilden sich zwei Schichten.Die obere wässrige Phase enthält virale Nukleinsäuren, Kapside und Proteine, während die untere Freon-Phase virale und zelluläre Membranen enthält. Mit einer Pipettenspitze mit großer Öffnung wird die obere Phase unter Vermeidung der Grenzfläche gesammelt und in ein frisches 50-Milliliter-Kegelrohr überführt. Es ist wichtig, die Freon-Phase nicht zu berühren und diesen organischen Lösungsmittel nicht in die wässrige Phase im neuen Röhrchen zu übertragen.Geben Sie Freon hinzu und wirbeln Sie erneut, wie zuvor beschrieben, um die Freon-Extraktion nach der Zentrifugation zu wiederholen. Sammeln Sie die obere Phase, etwa fünf Milliliter, und überführen Sie sie in ein neues Polyamid-Ultrazentrifugenröhrchen. Geben Sie Beamr Capto Ethanol auf eine Endkonzentration von 0,043 % zu den beiden verbleibenden Glycerol-LCM-Puffern hinzu.Danach zur Herstellung eines Gradienten in dem Polymer-Zentrifugenröhrchen ein dünnes Pipettiergerät verwenden, um das Freon-Extrakt mit drei Milliliter 5 %igem Glycerol-LCM unterzuwandern. Anschließend dieses mit 2,5 Milliliter 45 %igem Glycerol-LCM unterwandern. Gegebenenfalls ein entsprechendes Auswuchtröhrchen mit denselben Anteilen an LCM-Puffern vorbereiten.Die Röhrchen in Ultrazentrifugenröhrchen geben und durch vorsichtiges Hinzufügen von zusätzlichem 0 % Glycerol-LCM-Puffer in die oberste Schicht jeweils 50 bis 100 Mikroliter auswiegen, bis sie innerhalb von 0,1 Gramm zueinander ausbalanciert sind. Die ausbalancierten Proben während der Ultrazentrifugation eine Stunde lang bei 77.000 × g und vier Grad Celsius zentrifugieren. Einen Glasheberpipetteneinsatz verwenden, um einen Haken zu formen, mit dem schwimmende DNA im Ethanolpräzipitationsschritt aufgefangen werden kann.Halten Sie beide Enden der Pipette fest und führen Sie den mittleren Abschnitt über die Flamme. Wenn ein Glasabschnitt warm ist, ziehen Sie vorsichtig, um das Glas zu dehnen. Biegen Sie es sanft, um einen engen Winkel von weniger als 90 Grad zu erzeugen, und ziehen Sie dann kräftig, um das Ende abzuschließen.Wenn die Spitze des Glasösenhakens offen ist, halten Sie die Spitze über die Flamme, sodass das Glas so weit schmilzt, dass sie sich schließt. Nach der Ultrazentrifugation befindet sich ein dünnes, undurchsichtiges Pellet mit einem dunklen Fleck in der Mitte, das das virale Nukleo enthält. Aspirieren Sie vorsichtig die Flüssigkeit aus dem Röhrchen, einschließlich der Abläufe an den Seiten, wobei Sie das Pellet am Boden des Röhrchens vermeiden.Gebe 0,5 Milliliter TNE bei Raumtemperatur hinzu. Lasse das Pellet mindestens 10 Minuten lang stehen, um die Hydratation des Pellets zu ermöglichen. Falls das Verfahren erst am nächsten Tag fortgesetzt wird, stelle das resuspendierte Pellet bei vier Grad Celsius auf. Unter Verwendung einer P-200-Pipettenspitze das hydratisierte Pellet durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren aufbrechen. Keine Sorge wegen Scherschäden in diesem Schritt, da die virale DNA zu diesem Zeitpunkt noch in Kapsiden enthalten ist. Um die Kapside zu öffnen, folgende Komponenten zum viralen Pellet hinzufügen: 4,25 Milliliter TNE, 0,25 Milliliter 10 % SDS und zwei Milligramm Protein EK bei Raumtemperatur.Vorsichtig schwenken, um diese Reagenzien zu mischen. Es sollte nun eine leichte Zunahme der Viskosität auftreten, da die Kapside zerstört wurden. Achten Sie darauf, die DNA nicht zu fragmentieren; verwenden Sie Pipetten mit großer Öffnung und wirbeln Sie das virale Material nicht, um die viralen Proteine zu extrahieren.Überführen Sie die Probe in ein Phasen-Trenngel-Röhrchen und geben Sie fünf Milliliter Phenol-Chloroform hinzu. Beginnen Sie unverzüglich mit dem Vorsichtigem Umstülpen, um eine Emulsion durch mindestens 10 Sekunden andauerndes Umstülpen zu erhalten. Anschließend zentrifugieren Sie die Emulsion fünf Minuten lang bei 2000 RCF bei Raumtemperatur.Nach dem Zentrifugieren nehmen Sie die obere Schicht und überführen sie in ein neues Phasentrenngel-Röhrchen. Wiederholen Sie die Phenol-Chloroform-Extraktion und zentrifugieren Sie erneut nach der zweiten Phenol-Chloroform-Extraktion. Sammeln Sie die obere Schicht in einem 30-Milliliter-Glaskolben und kühlen Sie den Kolben 10 bis 15 Minuten lang bei minus 20 Grad Celsius ab.Darauf achten, dass es nicht einfriert. 10 Milliliter gerätekaltetes Ethanol hinzufügen. Das Gefäß verschließen und umdrehen, um zu mischen.Beobachten Sie unmittelbar das Auftreten eines DNA-Geistes, der aus einem dünnen, strähnigen Präzipitat besteht. Drehen Sie das Gefäß vorsichtig um, um die Mischung weiter zu homogenisieren und die klebrigen DNA-Präzipitate zum Zusammenklumpen zu bringen. Entnehmen Sie abschließend die DNA-Geister vorsichtig mit einem Glashaken und tupfen Sie die DNA durch vorsichtiges Auflegen mit einem Kim-Tuch ab, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.Danach die Hakenspitze nach unten in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen geben. Um die DNA-Ausbeute zu maximieren, brechen Sie den Glasheber in das 1,5-Milliliter-Röhrchen ab, sodass die Aufschlämmung von den Glasfragmenten im Laufe der Zeit weiter fortgesetzt werden kann. Trocknen lassen und 0,25 bis 0,5 Milliliter TE hinzufügen, um den DNA-„Geist“ aufzulösen.Lassen Sie die Resuspension der DNA mindestens eine Stunde lang andauern und lagern Sie die DNA bei vier Grad Celsius. Virale DNA wurde aus Nucleokapsiden wie in diesem Videoartikel beschrieben präpariert; hier wird ein repräsentatives Beispiel eines gut ausgebildeten und reichlich vorhandenen DNA-Ghosts gezeigt, das aus linearer, viraler genomischer DNA besteht, die in Lösung präzipitiert wurde. Die Stränge lagern sich zusammen und benötigen Zeit zur Wiederbefeuchtung, sobald sie in eine wässrige Lösung gegeben werden. Präparierte virale DNA aus PRV-Stämmen, Becker Bartha, und vier weiteren Stämmen wurde eine Stunde lang in einem 0,5 %igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt und mit Äthidiumbromid gefärbt.Jede PRV-Probe verwendet ein Mikroliter einer viralen DNA-Nukleokapsid-Präparation mit einem Gesamtvolumen von 250 Mikrolitern auf der linken Seite. Eine Größenleiter aus Lambda-Bakteriophagen-DNA. Die digestierte DNA zeigt die große Größe der undigestierten Lambda-DNA mit 48,5 Kilobasenpaaren und der PRV-Genom-DNA mit etwa 140 Kilobasenpaaren.Anschließend zeigt eine Verdünnungsreihe mit bekannten Mengen an Lambda-DNA, dass die Konzentration der PRV-Proben auf der rechten Seite zwischen 50 und 200 Nanogramm pro Mikroliter variiert, was einer Gesamtausbeute von 12 bis 50 Mikrogramm pro Virus entspricht. DNA-Präparationen, die virale DNA-Proben aus vier PRV-Stämmen enthielten, wurden über Nacht mit entweder BAM H one oder KPN one verdaut. Mit Restriktionsenzymen behandelte DNA-Proben wurden durch nächtliche Elektrophorese an einem 0,8 %igen Agarosegel getrennt und mit Athidiumbromid gefärbt.Die H1-Gele enthalten jeweils acht Mikrogramm virales Nukleokapsid-DNA, während die KPN1-Gele vier Mikrogramm virales DNA enthalten. Unterschiedliche PRV-Stämme können anhand ihrer jeweiligen Beschränkungs-Fragmentlängen-Polymorphismus-Muster unterschieden werden. Nach dieser Methode können weitere Verfahren wie die Tiefensequenzierung durchgeführt werden, um Daten zum viralen Genominhalt zu erhalten. Durch die Entwicklung dieser Technik wurde es Forschern auf dem Gebiet der Virologie ermöglicht, virales DNA mittels Restriktions-Fragmentlängen-Polymorphismen (RFLPs), Southern-Blotting, Klonierung, Konstruktion rekombinanter DNA-Viren und weiterer Manipulationen von Herpesviren sowie anderen Virenarten zu charakterisieren.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Fon äußerst gefährlich sein kann, und ergreifen Sie stets Vorsichtsmaßnahmen wie die Arbeit in einer Abzugshaube, während Sie dieses Verfahren durchführen. Nach dem Zentrifugieren kann sich die Fon-Schicht schnell von einem gallertartigen Halbfeststoff in eine Flüssigkeit verwandeln, weshalb jedes Reagenzglas einzeln beurteilt werden sollte, bevor entschieden wird, ob das Abgießen oder Pipettieren der bessere Weg ist, um die obere wässrige Phase zu sammeln.

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Research

Forschung

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