Name: Herstellung viraler DNA aus Nukleokapside (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 45 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung hochreiner Herpesvirus-Nukleokapsid-DNA aus infizierten Zellen mittels Ultrazentrifugation und Phenol-Chloroform-Extraktion. Diese Methode liefert DNA in hoher Konzentration und Reinheit für Sequenzierung und Transfektionen.

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Die Autoren schätzen die Beiträge Greg Smith, Lisa Pomeranz, Matt Lyman, Marlies Eldridge, Halina Staniszewska Goraczniak, und die Mitglieder des Enquist Labor in die Feinabstimmung dieses Protokoll.

1. Erster Tag: Virusinfektion und Herstellung der Puffer <ol><li> Bereiten 5-10 Gerichte (15 cm Durchmesser) Gewebekulturzellen für eine Infektion, simplex zB PK-15-Zellen für Pseudorabiesvirus (PRV) oder Vero-Zellen für Herpes-Virus (HSV). </li><li> Wenn die Zellen 95 sind - 100% konfluent, infizieren sie zu einem (MOI) von 5-10. Um dies zu tun, impfen jede Platte mit Viren Lager in einem Gesamtvolumen von 4 ml pro Platte, dann inkubieren die Platten für 1 Stunde bei 37 ° C. Rock-Platten sanft alle 15 Minuten, um sicherzustellen, dass die Zellmonolayer vollständig beschichtet mit dem Virus Inokulum bleibt. In der Zwischenzeit, warm das Medium für den nächsten Schritt. </li><li> Nach einer Stunde der Infektion, absaugen viralen Inokulum von den Platten, 15 ml warmes Medium und Inkubation bei 37 ° C für 12-20 Stunden in einem befeuchteten Inkubator. </li><li> Bereiten LCM-Puffer (siehe Tabelle 1) und Rock-Nacht bei 4 ° C für eine gute Durchmischung. Bereiten TNE zur Resuspension der viralen DNA (siehe Tabelle 2). </li></ol> 2. Zweiter Tag, Phase 1: Cell Lysis und Ultrazentrifugation <ol><li> Visuell, dass die Infektion der Zellen hat einheitliche zytopathischen Effekts (CPE) verursacht. Lassen Infektion, um die Fortschritte, bis alle Zellen aufgerundet haben, aber noch nicht von der Platte gehoben. </li><li> Kratzen Sie die infizierten Zellen in das Medium, und kombinieren Zellen und Medium in 50 ml konische Röhrchen. Die Zahl der konischen Rohren für diesen Schritt benötigt wird von der Anzahl der Gerichte für eine Infektion in Schritt 1.2 oben abhängen, kann z. B. ein 50 ml konischen Rohr zu Pellets verwendet werden maximal 3 Gerichte von 15 ml Medium je Optional:. Spülen Platten mit 10 ml PBS und mit den Zellen und Medium zu verbinden. </li><li> Centrifuge Zellen und Medium für 10 Minuten bei 2000 relativ centifugal (RZB) bei Raumtemperatur, dann absaugen Überstand und resuspendieren jedes Pellet in 10 ml PBS. Wenn die Pellets aus einer Virusinfektion in mehrere konische Röhrchen in Schritt 2.2 verteilt wurde, können diese in einem konischen Rohr bei diesem Schritt wieder zusammengeführt werden. Wiederholen Sie die Zentrifugation und Aspiration. Optional: Das Pellet kann bei -20 ° C gelagert werden und das Protokoll weiter zu einem späteren Zeitpunkt. </li></ol> 3. Zweiter Tag, Phase 2: Ultrazentrifugation Halten Sie das Zellpellet und LCM-Puffer auf Eis, wenn möglich während der folgenden Schritte. <ol><li> Add β-Mercaptoethanol auf 0% Glycerin - LCM-Puffer. Begin Kühlung der Ultrazentrifuge (für Schritt 3,9 unten), indem Sie sie auf 4 ° C und das Einschalten des Vakuums. </li><li> Zellpellet in 5 ml von 0% Glycerin - LCM-Puffer, bis es nicht mehr klumpig. Wenn nötig, Wirbel das Rohr zu brechen alle ungelösten Zellpellet. </li><li> Auszug durch Zugabe von 1,5 ml Freon (1,1,2-Trichlor-1 ,2,2-trifluorethan) und Vortex kräftig. Sofort für 10 min bei 2000 rcf zentrifugiert bei einer Temperatur von 4 ° C. Sammeln Sie die obere Schicht mit einem breiten Bohrung Pipettenspitze (Vermeidung der Schnittstelle) und Transfer in ein neues Röhrchen Optional:. Wenn das Pellet einer gallertartigen solide, können Sie schnell gießen Sie die obere Schicht in ein neues Röhrchen. </li><li> Wiederholen Sie die Freon-Extraktion und Zentrifuge wieder. </li><li> Sammeln Sie die obere Schicht (~ 5 ml) und an einem neuen Polyallomer Ultrazentrifuge Röhre. Add β-Mercaptoethanol auf die beiden verbleibenden Glycerin - LCM-Puffer. </li><li> Bereiten Sie einen Gradienten in der Polyallomer Zentrifugenröhrchen durch Unterlegen der Freon-Extrakt (oberste Schicht) mit 3 ml 5% Glycerin - LCM (Mittelschicht) und dann wieder Unterlegen mit 2,5 ml 45% Glycerin - LCM (untere Schicht). Verwenden Sie einen dünnen Pipette zum Überlaufen des Rohres Inhalte zu verhindern. </li><li> Falls erforderlich, bereiten eine entsprechende Balance Rohr mit den gleichen Anteilen von LCM-Puffer. </li><li> Transfer-Rohre in Ultrazentrifuge Eimer. Balance-Eimern bis zu 0,1 g voneinander, durch vorsichtiges Hinzufügen zusätzlicher 0% Glycerin - LCM-Puffer, um die oberste Schicht (~ 50-100 ul zu einem Zeitpunkt). </li><li> Mit einem kalten Ultrazentrifuge mit einer horizontalen oder Ausschwingrotor, drehen Sie das ausgewogene Proben für 1 Stunde bei 77.000 rcf (z. B. 25.000 UpM für eine SW41Ti Rotor) bei einer Temperatur von 4 ° C. </li><li> Während Ultrazentrifugation, um ein Glas Haken schwimmenden DNA bei der Ethanol-Fällung (4,6 unten) zu erfassen. Halten Sie beide Enden ein Glas Pasteur-Pipette sowie die Aussetzung der mittlere Abschnitt über einer Flamme. Wenn ein Abschnitt des Glases fast geschmolzen ist, ziehen Sie vorsichtig auf das Glas strecken, biegen Sie es vorsichtig, um eine eng abgewinkelten Haken (&lt;90 Grad) zu erstellen, und ziehen Sie kräftig zu versiegeln Ende. Wenn die Spitze des Glases Haken offen ist, halten Sie die Spitze über der Flamme, so dass das Glas schmilzt genug, um es zu schließen. </li><li> Nach der Ultrazentrifugation, sollten Sie eine dünne opake Pellet mit einem dunklen Fleck in der Mitte zu sehen. Vorsichtig absaugen der Flüssigkeit aus dem Rohr, einschließlich Schmalz an den Seiten, aber unter Vermeidung der Pellet am Boden des Röhrchens. </li><li> 0,5 ml TNE bei Raumtemperatur. </li><li> Lassen Sie das Pellet für mindestens 10 Minuten lang Hydratation des Pellets zu ermöglichen. Optional: Das Pellet kann auch in TNE Nacht resuspendieren, wenn bei 4 ° C gehalten </li></ol> 4. Dritter Tag: "Ghost" DNA Niederschlag <ol><li> Break up das Pellet durch Pipettieren mit einer kleinkalibrigen Pipettenspitze (zB p200 Pipettenspitze). Mach dir keine Sorgen Scheren bei diesem Schritt, da die virale DNA ist noch in Kapside an dieser Stelle enthalten. Fügen Sie die folgenden Reagenzien auf das Röhrchen mit dem viralen Pellet bei Raumtemperatur, um Kapside zu zerstören: <ul><li> 4,25 ml TNE </li><li> 0,25 ml 10% SDS </li><li> 2 mg Proteinase K </li></ul> Schütteln Sie diese Reagenzien zu mischen. Es sollte ein leichter Anstieg der Viskosität. </li></ol> Hüten Sie sich vor Scheren von hier aus, z. B. die Verwendung großer Bohrung Pipetten und nicht vortexen der viralen Material <ol start="2"><li> Auszug viraler Proteine ​​durch Zugabe von 5 ml Phenol-Chloroform und beginnt sofort mit Invertieren oder Vortexen, um eine Emulsion zu erhalten. Mix für 10 Sekunden, dann Zentrifuge die Emulsion für 5 Minuten bei 2000 rcf bei Raumtemperatur. Sammeln Sie die obere Schicht mit einem breiten Bohrung Pipettenspitze, die Vermeidung der Schnittstelle und die Übertragung in ein neues Röhrchen Optional:. Verwenden Phase Lock Gel (PLG) Rohre in diesem Schritt, um eine Verunreinigung von der Oberfläche zu vermeiden. </li><li> Wiederholen Sie die Phenol-Chloroform-Extraktion und Zentrifuge wieder. </li><li> Nach dem zweiten Phenol-Chloroform-Extraktion, sammeln die oberste Schicht in eine 30 ml Glas Corex Röhrchen und Chill das Rohr bei -20 ° C für 10-15 Minuten, wobei darauf geachtet, dass sie nicht einfrieren. </li><li> 10 ml eiskaltem Ethanol, decken das Rohr (z. B. durch Recken ein Stück Parafilm M over the top) und invertieren, um sofort zu mischen. Achten Sie auf eine DNA "Geist" zu erscheinen, die aus einer dünnen klebrigen Niederschlag besteht. Das Röhrchen vorsichtig weiter vermischen und verursachen den klebrigen DNA ausfällt, um die Cluster zusammen. </li><li> Verwenden Sie ein Glas Haken, um die DNA ghost (s) zu erfassen. Sorgfältig Blot die DNA, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, dann setzen Sie den Haken (Spitze nach unten) in ein 1,5 ml-Tube und trocknen lassen. Add 0,25 bis 0,5 ml TE, um die DNA Geist aufzulösen. Lassen Resuspension der DNA für mindestens 1 Stunde vor. DNA bei 4 ° C. Optional: Um DNA-Ausbeute zu maximieren, brechen das Glas Haken in die 1,5-ml-Tube kann, so dass Resuspension von der Glassplitter im Laufe der Zeit weiter. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Bei einer ausreichend hohen MOI, sollten die Zellen vollständig CPE innerhalb von ~ 18 Stunden nach der Infektion (HPI) zu erreichen für Wildtyp-PRV-Stämme, und ~ 24 hpi für Wildtyp-HSV-1-Stämme (Abbildung 1). Sobald das infizierte Zellpellet geerntet wird, können die verbleibenden Schritte-Protokoll vollständig in einem langen Tag oder sich über zwei Tage (Abbildung 2). Bei der Vorbereitung Glas Haken an der DNA Geist zu erfassen, ist es wichtig, den Haken Winkel weniger als 90 Grad, so dass sie später in die Basis eines 1,5-ml-Tube (Abbildung 3) passen. Die Abdichtung der Spitze dieses Hakens verhindert DNA-Verlust in der Pipette. DNA Geister Form bei der Fällung und wird als weiße, zähe Fäden (Abb. 4) erscheinen. Diese aggregieren und kleben aneinander und / oder das Glas Haken benutzt, um die DNA zu erfassen. So das gleiche Glas Haken kann verwendet werden, um aufzusammeln mehrere Threads von DNA aus dem Niederschlag Lösung sein. <table border="1"><tbody><tr><td> Wählen Sie Spalte auf das gewünschte Volumen: </td><td> 10 ml </td><td> 15 ml </td><td> 20 ml </td><td> 40 ml </td></tr><tr><td> 1M KCL </td><td> 1,3 ml </td><td> 1,9 ml </td><td> 2,5 ml </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 1M Tris (pH 7,4) </td><td> 300 pl </td><td> 450 ul </td><td> 600 ul </td><td> 1,2 ml </td></tr><tr><td> 1M MgCl 2 </td><td> 50 pl </td><td> 75 ul </td><td> 100 ul </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> 0,5 EDTA </td><td> 10 pl </td><td> 15 ul </td><td> 20 pl </td><td> 40 ul </td></tr><tr><td> NP40/IGEPAL </td><td> 50 pl </td><td> 75 ul </td><td> 100 ul </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol (unmittelbar vor Gebrauch hinzugefügt) </td><td> 4,3 ul </td><td> 6,5 ul </td><td> 8,6 ul </td><td> 17,2 ul </td></tr><tr><td colspan="5"></td></tr><tr><td colspan="5"> Verwenden Anteile für gewünschte Prozent Glycerin (0, 5 oder 45%) </td></tr><tr><td> 0% Glycerin </td><td> Keiner </td><td> Keiner </td><td> Keiner </td><td> Keiner </td></tr><tr><td> Wasser </td><td> 8,3 ml </td><td> 12,5 ml </td><td> 16,7 ml </td><td> 33,4 ml </td></tr><tr><td> 5% Glycerin </td><td> 0,5 ml </td><td> 0,8 ml </td><td> 1,0 ml </td><td> 2,0 ml </td></tr><tr><td> Wasser </td><td> 7,8 ml </td><td> 11,7 ml </td><td> 15,7 ml </td><td> 31,4 ml </td></tr><tr><td> 45% glycerol </td><td> 4,5 ml </td><td> 6,8 ml </td><td> 9,0 ml </td><td> 18,0 ml </td></tr><tr><td> Wasser </td><td> 3,8 ml </td><td> 5,7 ml </td><td> 7,7 ml </td><td> 15,4 ml </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Rezepte für die Zubereitung von LCM-Puffer <table border="1"><tbody><tr><td> Für 50 ml Volumen </td></tr><tr><td> 5 ml 1M NaCl </td></tr><tr><td> 2,5 ml 1M Tris, pH 7,5 </td></tr><tr><td> 1 ml 0,5 EDTA </td></tr><tr><td> 41,5 ml H 2 O </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Vorbereitung der TNE (0,1 M NaCl, 50 mM Tris, pH 7,5, 10 mM EDTA) <table border="1"><tbody><tr><td> Für 1 Liter </td></tr><tr><td> 0,2 g KCl </td></tr><tr><td> 0,2 g KH 2 PO 4 </td></tr><tr><td> 8 g NaCl </td></tr><tr><td> 1,15 g Na 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> H 2 O auf 1L </td></tr></tbody></table> Tabelle 3. Herstellung des PBS (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4, 137 mM NaCl und 8,1 mM Na 2 HPO 4, pH 7,0) <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. PK15-Zellen (A) vor der Infektion, (B) auf halbem Wege durch Infektion und (C) auf zytopathischen Effekt (CPE), nachdem eine hohe Multiplizität der Infektion. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Überblick über das Protokoll. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Drei repräsentative Beispiele aus Glas Haken benutzt, um die virale DNA Geister zu sammeln. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Repräsentatives Beispiel für eine wohlgeformte und reichlich DNA "Geist".

<ol><li>Szpara, M. L., Parsons, L., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+variability+in+clinical+and+laboratory+isolates+of+herpes+simplex+virus+1+reveals+new+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations.</a> J Virol. 84, 5303-5313 (2010).</li>
<li>Banfield, B. W., Kaufman, J. D., Randall, J. A., Pickard, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+pseudorabies+virus+strains+expressing+red+fluorescent+proteins%3A+new+tools+for+multisynaptic+labeling+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development of pseudorabies virus strains expressing red fluorescent proteins: new tools for multisynaptic labeling applications.</a> J Virol. 77, 10106-10112 (2003).</li>
<li>Kobiler, O., Lipman, Y., Therkelsen, K., Daubechies, I., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpesviruses+carrying+a+Brainbow+cassette+reveal+replication+and+expression+of+limited+numbers+of+incoming+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Herpesviruses carrying a Brainbow cassette reveal replication and expression of limited numbers of incoming genomes.</a> Nat Commun. 1, 146-146 (2010).</li>
<li>Enquist, L. W., Madden, M. J., Schiop-Stanley, P., Vande Woude, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+herpes+simplex+type+1+DNA+fragments+in+a+bacteriophage+lambda+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cloning of herpes simplex type 1 DNA fragments in a bacteriophage lambda vector.</a> Science. 203, 541-544 (1979).</li>
<li>Smith, G. A., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+transposon+mutagenesis+in+Escherichia+coli+of+a+full-length+infectious+clone+of+pseudorabies+virus%2C+an+alphaherpesvirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Construction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-length infectious clone of pseudorabies virus, an alphaherpesvirus.</a> J Virol. 73, 6405-6414 (1999).</li>
<li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFlint%2C+SJ+%22Principles+of+virology%22">Principles of virology</a>. , 3rd edn, ASM Press. (2008).</li>
<li>Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+pseudorabies+virus%3A+impact+on+neurovirology+and+veterinary+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 69, 462-500 (2005).</li>
<li>Roizman, B., Pellett, P. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoizman%2C+B+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. , 2 ed, Lippincott Williams & Wilkins. 2381-2397 (2001).</li>
<li>Mendez, I. I., Hermann, L. L., Hazelton, P. R., Coombs, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+analysis+of+freon+substitutes+in+the+purification+of+reovirus+and+calicivirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A comparative analysis of freon substitutes in the purification of reovirus and calicivirus.</a> J Virol Methods. 90, 59-67 (2000).</li>
<li>Gharabaghi, F., Aymard, M., Trotemann, P., Gerdil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+simplified+micromethod+for+subtyping+varicella-zoster+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">A rapid and simplified micromethod for subtyping varicella-zoster virus.</a> J Med Virol. 31, 129-134 (1990).</li>
<li>Granstedt, A. E., Szpara, M. L., Kuhn, B., Wang, S. S., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+monitoring+of+in+vivo+neural+activity+using+a+circuit-tracing+pseudorabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based monitoring of in vivo neural activity using a circuit-tracing pseudorabies virus.</a> PLoS One. 4, e6923-e6923 (2009).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Teile dieses Protokoll wurden ursprünglich für die virale DNA-Isolierung in BSL4 Bedingungen entwickelt, aber es passt ebenso gut auf nicht-BSL Bedingungen. 4 Wir verwenden häufig dieses Protokoll, um DNA aus den Alpha-Herpesviren PRV und HSV-1, das DNA-Genome sind zu isolieren eingeschlossen in einem proteinhaltigen Kapsid, umgeben von einer Lipid-Hülle. 7,8 Jedoch ist es wahrscheinlich, direkt anpassungsfähig zu anderen großen DNA-Viren, wie zB Beta-und Gamma-Herpesviren und Adenoviren. Ähnliche ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Freon (1,1,2-Trichlor-1 ,2,2-trifluorethan) </td><td> Fischer </td><td> T178-4 </td><td> Erkundigen Sie sich bei Ihrer Institution Richtlinien zur angemessenen Entsorgung von Freon-haltigen Abfällen, oder sehen Sie Mendez et al. für potenzielle Freon Alternativen. 9 </td></tr><tr><td> Phase Lock Gel Röhrchen, Heavy 15ml Kapazität </td><td> 5 PRIME </td><td> 2302850 </td><td> Fakultativ </td></tr><tr><td> Polyallomer Ultrazentrifuge Rohre </td><td> Beckman * </td><td> 331372 * </td><td> * Wählen Sie Röhren für Ihre eigenen Ultrazentrifuge, diese sind nur als Beispiel enthalten </td></tr><tr><td> NP-40 / IGEPAL </td><td> Sigma </td><td> I-3021 </td><td></td></tr><tr><td> PK-15-Zellen </td><td> ATCC </td><td> CCL-33 </td><td></td></tr><tr><td> Vero-Zellen </td><td> ATCC </td><td> CCL-81 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> HyClone </td><td> SH30028.03 </td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung viraler dna aus nukleokapside

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Viren sind obligate Parasiten zellulären und damit die Untersuchung ihrer DNA erfordert Isolierung viraler Material vom Wirtszelle Verunreinigungen und DNA. Mehrere nachgelagerten Anwendungen erfordern große Mengen an reiner viraler DNA, die durch dieses Protokoll vorgesehen ist. Zu diesen Anwendungen zählen virale Genom-Sequenzierung, in denen die Beseitigung der Wirts-DNA ist entscheidend für die Datenausgabe für virale Sequenzen zu optimieren und die Produktion neuer viraler rekombinanten Stämmen, wo Co-Transfektion von gereinigter Plasmid-und lineare virale DNA erleichtert Rekombination. 1,2, 3 Dieses Verfahren verwendet eine Kombination von Extraktionen und Dichte-basierte Zentrifugieren zu isolieren gereinigten linearen Herpesvirus Nukleokapsid DNA aus infizierten Zellen. 4,5 Die ersten Reinigungsschritte Ziel gereinigten viralen Kapside zu isolieren, die enthalten und schützen die virale DNA während der Extraktion und Zentrifugationsschritte dass zelluläre Proteine ​​und DNA zu entfernen. Lysis von Nukleokapside gibt dann die virale DNA, und zwei abschließende Phenol-Chloroform Schritte entfernen verbleibenden Proteine. Die endgültige DNA aus der Lösung erfasst ist hoch konzentriert und rein, mit einer durchschnittlichen OD 260/280 von 1,90. Je nach der Menge der infizierten Zellen verwendet, die Erträge der viralen DNA-Bereich von 150 bis 800 ug oder mehr. Die Reinheit dieser DNA macht es stabil während der Langzeit-Lagerung bei 4C. Diese DNA ist somit ideal für Hochdurchsatz-Sequenzierung, high fidelity PCR-Reaktionen, und Transfektionen geeignet. Vor Beginn des Protokolls, ist es wichtig, die durchschnittliche Anzahl der Zellen pro Schale (z. B. durchschnittlich 8 x 10 6 PK-15-Zellen in einer konfluenten 15 cm Schale), und der Titer der viralen Lager verwendet werden wissen ( zB 1 x 10 8 Plaque-bildenden Einheiten pro ml). Diese sind notwendig, um die entsprechende Multiplizität der Infektion (MOI) für das Protokoll zu berechnen. 6 Zum Beispiel, um eine 15 cm Schüssel mit PK-15-Zellen mit den oben genannten viralen Lager, bei einer MOI von 5 infiziert, würden Sie 400 ul viralen Lager und verdünnen Sie es mit 3,6 ml Medium (insgesamt Impfung Volumen von 4 ml für eine 15 cm-Platte). Mehrere virale DNA-Präparate können zur gleichen Zeit vorbereitet werden. Die Anzahl der gleichzeitigen Vorbereitung ist nur durch die Anzahl der Rohre durch die Ultrazentrifuge Rotor statt Limited (einer pro-Virus; siehe Schritt 3,9 unten). Hier beschreiben wir das Verfahren, als ob die für einen Virus getan.

Wir beschreiben den Prozess der Isolierung hochreiner Herpesvirus Nukleokapsid DNA aus infizierten Zellen. Die endgültige DNA aus der Lösung erfasst ist von hoher Konzentration und Reinheit und ist damit ideal für Hochdurchsatz-Sequenzierung, high fidelity PCR-Reaktionen, und Transfektionen neue virale Rekombinanten produzieren geeignet.

Herstellung viraler DNA aus Nukleokapside

Viren sind obligate Zellparasiten, weshalb die Untersuchung ihrer DNA die Isolierung des viralen Materials von Kontaminanten und der DNA der Wirtszelle erfordert. ...

Dieses Video demonstriert ein Verfahren zur Isolierung von hochreinen viralen Nukleokapsiden und DNA aus infizierten Zellen. Zunächst werden lipidhaltige Membranen durch eine zweifache Gefriertrocknung während der Extraktion denaturiert. Anschließend wird die Probe ultrazentrifugiert, um die viralen Nukleokapside als Pellet abzutrennen und sie von leichteren zellulären und viralen Bestandteilen zu separieren.Es werden Detergenzien und Proteinase K hinzugefügt, um die virale DNA aus den pelletierten Nukleokapsiden freizusetzen. Anschließend werden zwei Phenol-Chloroform-Extraktionen durchgeführt, um alle verbleibenden Proteine zu entfernen. Schließlich wird die virale DNA in Lösung ausgefällt.Letztlich zeigen die Ergebnisse, dass aus diesen infizierten Zellen hochkonzentrierte und reine virale DNA isoliert wurde. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden, die keine Freisetzung ungebundener Extrakte oder Ultrazentrifugation beinhalten, liegt darin, dass die hier erzeugte virale DNA nur sehr geringe Mengen an Wirtszell-DNA-Verunreinigungen aufweist und sich somit ideal für nachgeschaltete Verfahren wie PCR und die Tiefe Sequenzierung viraler Genome eignet. Wir ver

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Forschung

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Immunology and Infection

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Einzel-Virus Genomics (SVG) ist eine Methode zur Isolierung und verstärken die Genome einzelner virons. Virussuspensionen einer gemischten Anordnung sortiert werden mittels Durchflusszytometrie auf einen Objektträger mit diskreten Vertiefungen, Agarose, wodurch die Erfassung des Virions und Verringerung Genom Scherung während der Weiterverarbeitung. Amplifikation des gesamten Genoms erfolgt über mehrere Displacement Amplification (MDA), was genomische Material, das für die Sequenzierung...

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Bakterielle künstliche Chromosomen: A Functional Genomics-Werkzeug für das Studium der Positiv-Strang-RNA-Viren

Wir bieten eine neuartige Strategie zur Isolierung von viralen Replikationskompartimenten (RC) aus Adenoviren (Ad)-infizierten menschlichen Zellen an. Dieser Ansatz stellt ein zellfreies System dar, das dazu beitragen kann, die molekularen Mechanismen aufzuklären, die die Replikation und Expression des viralen Genoms sowie die Regulation der am RC etablierten Virus-Wirt-Interaktionen regulieren.

Isolierung der viralen Replikation Compartment angereicherte Teil nuklearen Fraktionen von Adenovirus-infizierten normalen menschlichen Zellen

Die Demontage von Influenza-A-Viruskernen während des Viruseintritts in Wirtszellen ist ein mehrstufiger Prozess. Wir beschreiben eine in vitro Methode, um die frühen Stadien der viralen Enthüllung zu analysieren. Bei diesem Ansatz wird die Geschwindigkeitsgradientenzentrifugation verwendet, um die Schritte, die die Entschichtung unter definierten Bedingungen einleiten, biochemisch zu zerlegen.

In - vitro - Zerlegung von Influenza - A - Virus Kapside durch Gradientenzentrifugation

Hier stellen wir ein Protokoll für die Synthese von virusähnlichen Partikeln entweder Baculovirus oder Säuger-Expressionssystemen und Ultrazentrifugation Reinigung. Dieser hochgradig anpassbare Ansatz wird verwendet, um virale Antigene als Impfstoff Ziele in eine sichere und flexible Art und Weise identifizieren.

Expression und Reinigung von virusähnlichen Partikeln zur Vakzinierung

Dieses Protokoll beschreibt eine schnelle und breit anwendbare Methode zur unvoreingenommenen RNA-Sequenzierung von Virusproben aus menschlichen klinischen Isolaten.

Unvoreingenommene Tiefe Sequenzierung von RNA-Viren aus klinischen Proben

Das Ziel dieses Protokolls ist speziell markieren und virale DNA aus infizierten Zellen für die Charakterisierung des Virusgenoms verbundenen Proteine selektiv zu isolieren.

Reinigung der viralen DNA für die Identifizierung von assoziierten viralen und zellulären Proteinen

Hier präsentieren wir einen neuen Ansatz zur Identifizierung von Pflanzenviren mit Doppel-Strang DNA Genom. Wir verwenden standard-Methoden zu extrahieren von DNA und RNA aus den infizierten Blättern und Next Generation Sequencing durchzuführen. Bioinformatische Werkzeuge montieren Sequenzen in Contigs, Contigs Vertretung Virus Genome zu identifizieren und Genome taxonomischen Gruppen zuweisen.

Kombination von Analyse von DNA in eine grobe Virion-Extraktion mit der Analyse der RNA aus den infizierten Blättern, entdecken neue Virus-Genom

Für eine eingehende mechanistische Analyse der RNA-Synthese des respiratorischen Synzytialvirus (RSV) berichten wir über ein Protokoll zur Verwendung des Chaperonphosphoproteins (P) zur Koexpression des RNA-freien Nukleoproteins (N0)für die anschließende in vitro-Assemblierung der virusspezifischen Nukleokapside (NCs).

Generierung und Aufbau virusspezifischer Nukleokapsiden des respiratorischen Synzytialvirus

Erfahren Sie die Isolierung hochreiner Herpesvirus-Nukleokapsid-DNA aus infizierten Zellen mittels Ultrazentrifugation und Phenol-Chloroform-Extraktion. Diese Methode liefert DNA in hoher Konzentration und Reinheit für Sequenzierung und Transfektionen.

Herstellung viraler DNA aus Nukleokapside

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