Retrograde Markierung von Drosophila-Motoneuronen mit fluoreszierenden lipophilen Farbstoffen

Beginnen Sie mit einem sezierten Drosophila-Embryo, der auf einem Glasobjektträger befestigt ist und mit Klebeband umgeben ist.

Die Motoneuronen der Fliege sind zur Visualisierung fluoreszierend markiert.

Visualisieren Sie den Embryo mit einem Mikroskop und positionieren Sie eine grün fluoreszierende, lipophile, mit Farbstoffen gefüllte Mikropipette in der Nähe des Embryos.

Wechseln Sie dann in den Fluoreszenzmodus und lokalisieren Sie die axonale Spitze des Motoneurons an der neuromuskulären Verbindung, wo das Motoneuron mit dem Muskel verbunden ist.

Wechseln Sie in den Hellfeldmodus, berühren Sie die Spitze des Zielaxons mit der Pipette, geben Sie einen Farbstofftropfen ab und inkubieren Sie dann.

Aufgrund ihrer lipophilen Natur und axonalen Nähe dringen die Farbstoffe selektiv in die lipidreiche Membran des Zielaxons ein.

Im Laufe der Zeit wandert der Farbstoff rückwärts, bewegt sich rückwärts entlang der axonalen Lipiddoppelschicht in Richtung des neuronalen Körpers und markiert die neuronalen Projektionen.

Entfernen Sie das Klebeband von der Folie und legen Sie ein Deckglas an.

Beobachten Sie den Objektträger unter einem konfokalen Mikroskop.

Das retrograde markierte Zielneuron erscheint in grüner Fluoreszenz und zeigt eine detaillierte neuronale Morphologie und Projektionen.

Ziehen Sie den Embryo mit einer Glasnadel unter einem Seziermikroskop aus der Vitellinmembran vom Klebeband auf das Glas und achten Sie darauf, das innere Gewebe des Embryos nicht zu beschädigen. Schneiden Sie dann die Mittellinie eines einzelnen Embryos an seiner Oberfläche von seinem hinteren nach seinem vorderen Ende durch. Drehen Sie das Epithelgewebe von der Mitte aus um und befestigen Sie den epidermalen Rand an der Oberfläche des Objektträgers.

Verwenden Sie eine mit dem Schlauch verbundene Nadel mit einer Spitzenöffnung von etwa 300 Mikrometern, um Luft anzusaugen oder zu blasen, um die dorsalen longitudinalen Trachealstämme sowie alle verbleibenden Eingeweide zu entfernen. Verwenden Sie 4% PFA und PBS, um die Embryonen 5 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler zu fixieren. Waschen Sie sie dann dreimal mit PBS.

Färben Sie die Embryonen mit 1 Mikroliter Anti-Meerrettich-Peroxidase-Antikörper, konjugiert mit Cyanin-3-Farbstoff und 200 Mikrolitern PBS für eine Stunde auf dem Orbitalschüttler. Und wiederholen Sie die Wäschen in PBS. Um die Injektionsmikropipette zu füllen, setzen Sie sie in den Kapillarhalter ein. Platzieren Sie als Nächstes den Farbobjektträger auf der Bühne und positionieren Sie ihn mit dem Mikromanipulator über dem Objektträger.

Stellen Sie dann den Tisch so ein, dass die Mikropipette auf dem Farbstoff platziert wird. Sammeln Sie den Farbstoff und die Mikropipette, indem Sie den Injektionsdruck auf 200 bis 500 Hektopascal, die Injektionszeit zwischen 0,1 und 0,5 Sekunden und den Kompensationsdruck auf 0 für 5 Minuten einstellen. Sobald der Farbstoff gesammelt wurde, entfernen Sie den Farbobjektträger und legen Sie die Probe auf den Mikroskoptisch.

Erhöhen Sie dann den Ausgleichsdruck auf einen Bereich von 30 bis 60 Hektopascal und senken Sie die Mikropipette in die Probe ab. Verwenden Sie die 10-fache Objektivlinse, um den Embryo zu lokalisieren und die Mikropipette auf den Embryo auszurichten. Tauschen Sie das Objektiv gegen ein 40-fach-Wasserimmersionsobjektiv aus und tauchen Sie das Objektiv in das PBS ein.

Mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie können Sie die mit Anti-HRP Cy3 markierte neuronale Morphologie überprüfen und die Injektionsstelle bestimmen. Wenn sich der Embryo im Fokus befindet, ändern Sie die Position der Mikropipette, um einen sanften Kontakt mit der Spitze des Axons von Interesse herzustellen. Verwenden Sie dann während der Injektion eine Hellfeldmikroskopie, um das Farbstofftröpfchen zu sehen. Lassen Sie den Farbstoff in ein rechtes abdominales Hemisegment an der neuromuskulären Verbindung von ACC oder RP3 mit DiD oder DiO fallen.

Verwenden Sie die Handsteuerung, um den Farbstoff freizugeben und die Mikropipette zu entfernen. Gehen Sie dann zur nächsten Injektionsstelle über. Inkubieren Sie die Probe vor der Bildgebung 1 Stunde lang bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler. Entfernen Sie mit einer feinen Pinzette die Bänder vom Objektträger.

Um die Probe zu montieren, bereiten Sie ein Deckglas mit etwas Vakuumfett an den vier Ecken vor. Legen Sie es vorsichtig auf die Probe und achten Sie darauf, Luftblasen zu vermeiden. Drücken Sie das Deckglas nach unten, um den Abstand zur Probe so einzustellen, dass der Arbeitsabstand zwischen der Objektivlinse und dem Objektträger möglich ist.

Entfernen Sie überschüssiges PBS mit Aufgabentüchern. Versiegeln Sie die Ränder des Deckglases vollständig mit Nagellack. Bilde mit 10-facher und 100-facher Vergrößerung mit einem Konfokalmikroskop und verarbeite die Bilder mit der ImageJ-Software.