JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Neurowissenschaften
0 Aufrufe • 3:38 Min. • April 28th, 2025
Beginnen Sie mit primären hypothalamischen Neuronen vom Wildtyp und CCR5-Knockout-Maus, die auf Poly-D-Lysin-beschichteten Deckgläsern in einer Multi-Well-Platte kultiviert werden.
Diese Neuronen exprimieren im Zytoplasma den grün fluoreszierenden, proteinmarkierten Glukosetransporter-4 (GFP-GLUT4).
Übertragen Sie die Deckgläser auf Objektträger und wischen Sie überschüssiges Medium vorsichtig ab, um die Stabilität während der Bildaufnahme zu gewährleisten.
Legen Sie einen Objektträger mit dem Deckglas nach unten auf den Dekonvolutionsmikroskoptisch.
Visualisiere die Neuronen unter Hellfeldbeleuchtung, dann behandle sie nacheinander mit dem Chemokin CCL5 und Insulin.
Wechseln Sie zur Fluoreszenzbeleuchtung, um GFP-GLUT4-exprimierende Zielneuronen zu identifizieren und passen Sie die Bildgebungsparameter an, um Live-Fluoreszenzbilder aufzunehmen.
In Wildtyp-Neuronen binden Insulin und CCL5 an den Insulinrezeptor bzw. CCR5 und aktivieren so nachgeschaltete Signalwege, die die GFP-GLUT4-Membrantranslokation vorantreiben.
In CCR5-Knockout-Neuronen bindet CCL5 nicht, was zu einer reduzierten GFP-GLUT4-Translokation führt.
Nehmen Sie die Bilder auf und wenden Sie einen Entfaltungsalgorithmus an
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