Bildgebung der neuronalen Aktivierung im Hippocampus in Gehirnschnitten von Mäusen

Beginnen Sie mit Abschnitten des Mausgehirns, die den dorsalen Hippocampus freilegen, der reich an Neuronen ist.

Fügen Sie Wasserstoffperoxid hinzu, um die neuronale Peroxidaseaktivität zu unterdrücken, gefolgt von einem Waschen.

Behandeln Sie mit einem Permeabilisierungspuffer und wenden Sie dann einen Blockierungspuffer an, um die unspezifische Bindung zu blockieren.

Fügen Sie die primären Antikörper hinzu und inkubieren Sie unter Bewegung. Diese Antikörper binden an neuronale Aktivierungsmarkerproteine.

Waschen und wenden Sie Biotin-konjugierte Sekundärantikörper an, um die primären Antikörper zu binden.

Spülen und einen Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex einführen, der an Biotin auf den Konjugaten bindet.

Erneut waschen, dann ein chromogenes Substrat hinzufügen, das durch Peroxidase oxidiert wird, um einen braunen Niederschlag zu erzeugen. Stoppen Sie die Reaktion mit PBS.

Übertragen Sie die Abschnitte auf einen mit Gelatine beschichteten Objektträger und dehydrieren Sie sie mit steigenden Konzentrationen von Ethanol. Befreien Sie dann die Abschnitte mit Xylol und montieren Sie sie.

Platzieren Sie den Objektträger unter einem Hellfeldmikroskop.

Unter Lichtbeleuchtung lassen ungefärbte Bereiche Licht durch und erscheinen hell, während gefärbte Neuronen Licht absorbieren und reflektieren und dunkler erscheinen.

Der deutlich dunklere Bereich zeigt eine neuronale Aktivierung innerhalb des Hippocampus an.

Übertragen Sie drei bis fünf dorsale Hippocampus-Schnitte für jede Maus in die Vertiefungen einer 24-Multi-Well-Platte, die 500 Mikroliter 0,1 molare PBS für jede Vertiefung enthält. Waschen Sie die in jeder Vertiefung enthaltenen Abschnitte mit 500 Mikrolitern 0,1 molaren PBS. Alle Wäschen und Inkubationen bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren durchführen, sofern nicht anders angegeben. Unter einem Abzug werden die Schnitte 20 Minuten lang in 40 % Methanol und 1 % Wasserstoffperoxid in 0,1 molaren PBS inkubiert, um die endogene Peroxidaseaktivität zu löschen.

Nach drei weiteren Wäschen in 0,1 molaren PBS permeabilisieren Sie die Schnitte, indem Sie sie fünf Minuten lang in 500 Mikrolitern 0,2 % Triton X-100 inkubieren. Bereiten Sie während der Inkubation der Sektionen genügend Blockierungspuffer für das gesamte Experiment vor. Entfernen Sie dann die Permeabilisierungslösung und geben Sie 100 Mikroliter des Blockierungspuffers in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Abschnitte eine Stunde lang.

Entfernen Sie anschließend den Blockierungspuffer und bedecken Sie die Abschnitte mit phosphoryliertem extrazellulärem reguliertem Kinase-Primärantikörper, der 1 bis 500 in Blockierungspuffer verdünnt ist. Inkubieren Sie die Schnitte über Nacht bei 4 Grad Celsius unter leichtem Rühren. Am nächsten Tag, nachdem die Schnitte dreimal 5 Minuten lang in 0,1 molaren PBS gewaschen wurden, inkubieren Sie die Schnitte mit einem Biotin-konjugierten Sekundärantikörper, verdünnt 1 bis 250 Blockierungspuffer für eine Stunde bei Raumtemperatur.

Bereiten Sie das ABC-Reagenz während der Inkubation mindestens 30 Minuten vor der Verwendung vor, damit sich der Avidin- und Biotin-Komplex bilden kann. Nachdem Sie die Schnitte noch dreimal mit 0,1 molaren PBS gewaschen haben, fügen Sie das ABC-Reagenz hinzu und lassen Sie es 45 Minuten lang mit der Probe inkubieren. Bereiten Sie bei den nächsten drei Wäschen in PBS die Tupflösung im Abzug gemäß den Herstellerangaben vor. Aliquotieren Sie die Tupflösung in der Platte.

Übertragen Sie dann die Abschnitte in die Vertiefungen, die die DAB-Arbeitslösung enthalten, und schwenken Sie die Platte langsam, um eine maximale Exposition der Abschnitte mit der Lösung zu ermöglichen. Überwachen Sie die DAB-Reaktion am Mikroskop, bis sich in etwa zwei bis fünf Minuten ein ausreichendes Signal entwickelt. Stoppen Sie die Reaktion bei der gewünschten Farbintensität, indem Sie das Gewebe in 0,1 molaren PBS waschen. Nach drei weiteren Wäschen in PBS montieren Sie die Abschnitte auf gelatinebeschichtete Objektträger und trocknen Sie sie mindestens drei bis vier Stunden lang bei Raumtemperatur.

Sobald sie an der Luft getrocknet sind, übertragen Sie die Objektträger in den Abzug und entwässern Sie die Abschnitte, indem Sie sie nacheinander für jeweils zwei Minuten in abgestufte Ethanollösungen legen. Reinigen Sie dann die Objektträger fünf Minuten lang in 100% Xylol. Decken Sie die Dias mit einem Eindeckmedium ab und lassen Sie sie über Nacht im Abzug trocknen.

Übertragen Sie die Objektträger auf ein Hellfeldmikroskop, das mit einer Kamera mit 20-fach-Objektiv ausgestattet ist. Nehmen Sie mehrere Hellfeldbilder von jedem Abschnitt mit 200-facher Vergrößerung auf, die den dorsalen Hippocampus abdecken. Stellen Sie sich drei bis fünf Schnitte von jedem Tier vor.