Zwei-Photonen-In-vivo-Bildgebung der Netzhaut der Maus

Nimm eine anästhesierte transgene Maus, deren Kopf schräg auf einer Halterung befestigt ist, um in vivo die Netzhaut der Maus zu fotografieren.

Die Netzhaut enthält retinale Ganglienzellen oder RGCs, die ein Fluorophor-markiertes Protein exprimieren.

Tragen Sie Augenschmiermittel auf und befestigen Sie ein Deckglas über dem Auge.

Unter einem Mikroskop die Netzhaut gleichmäßig beleuchten, um die fluoreszierenden Proteine in den RGCs anzuregen.

Mit der emittierten Fluoreszenz erhalten Sie eine Weitwinkelansicht der RGCs der Brennebene und der unscharfen RGCs.

Wechsle in den Zwei-Photonen-Bildgebungsmodus und fokussiere niederenergetisches Nahinfrarotlicht in die RGC-Schicht.

Im Brennpunkt regt die kombinierte Energie von zwei Photonen das Fluorophor an, das dann Energie als Fluoreszenz freisetzt.

Da die Anregung auf einen einzigen Punkt beschränkt ist, wird die Fluoreszenz aus anderen Brennebenen minimiert.

Nehmen Sie Bilder in mehreren Fokusebenen entlang der z-Achse auf, um die gesamte RGC-Schicht abzubilden.

Tragen Sie Gleitmittel auf beide Augen der Maus auf. Drehen Sie den Hauptarm des Kopfhalters, bis die Pupille eines Auges in einer Linie mit dem Strahlengang ausgerichtet ist, und setzen Sie ein Deckglas mit der Nummer 1,5 in den kompakten Filterhalter ein. Nachdem Sie die Halterung am Mikroskoptisch befestigt haben, senken Sie das Deckglas ab, bis es mit dem Gleitmittel i-Gel in Berührung kommt, ohne die Hornhaut zu berühren. Und stellen Sie den Tisch in der xy-Dimension und der objektiven z-Position ein, bis das Weitfeld-Anregungslicht die Hornhaut vollständig bedeckt.

Verwenden Sie das Okular, um die z-Position weiter einzustellen, bis die fluoreszierenden Zellen oder Strukturen in der Netzhaut scharf werden, und erhöhen Sie die Epifluoreszenzbeleuchtung nach Bedarf, um einzelne Zellen oder Strukturen von Interesse aufzulösen. Passen Sie die Ausrichtung der Netzhaut an den Strahlengang der Bildgebung an. Passen Sie den Kopfwinkel so lange an, bis beim Ändern der Fokusebene nur noch eine Ausdehnung oder Kontraktion des unscharfen Lichts auftritt, wodurch XY-Verzerrungen minimiert werden.

Schalten Sie dann die Epifluoreszenzbeleuchtung aus und schließen Sie den Verschluss der Beleuchtung. Befolgen Sie für die Zwei-Photonen-Bildgebung alle institutionellen Lasersicherheitsprotokolle. Schalten Sie das gesamte Umgebungslicht aus und decken Sie es ab und schalten Sie den Anregungslichtweg auf den Laser und den Emissionslichtweg auf die PMTs um.

Stellen Sie in der Bildaufnahmesoftware die Bildgröße auf 512 x 512 und den Bilddurchschnitt auf 3 ein. Stellen Sie die Z-Stufe so ein, dass sie am oberen Rand des Stapels beginnt und nach unten fortschreitet, wodurch die Zwei-Photonen-Laseraktivierung der Photorezeptoren minimiert wird. Schalten Sie die PMTs ein und aktivieren Sie sie und stellen Sie die Spannung auf 680 Volt ein.

Aktivieren Sie die Bildgebungs- und Emissionsverschlüsse. Starten Sie eine Live-Bildvorschau des Zielgewebes ab einer Laserleistung von 1 % und passen Sie die Displayhelligkeit automatisch an, um die gewünschten Zellen oder Strukturen zu visualisieren. Wenn das Zielgewebe dunkel oder unklar ist, erhöhen Sie den Prozentsatz der Laserleistung, bis Strukturen sichtbar werden, ohne 45 Milliwatt zu überschreiten.

Manövrieren Sie den Mikroskoptisch in xy-Richtung, um ihn auf einen gewünschten Bildgebungsbereich zu zentrieren, und navigieren Sie zur z-Ebene, wobei die gewünschten Strukturen scharf gestellt werden. Öffnen Sie für ein chronisches Zeitrafferexperiment ein zuvor erhaltenes Bild, um es als Referenz für die interessierenden Zellen zu verwenden, und achten Sie darauf, dass der Bildgebungswinkel im aktuellen Bild dem der vorherigen Bilder ähnelt. Navigieren Sie dann zur oberen und untersten Z-Ebene, um die Z-Grenzen des Imaging-Stacks festzulegen und das Bild aufzunehmen.