Fluoreszenzbildgebung der neuroimmunen Dynamik mit Hilfe eines Schädelimplantats

Beginnen Sie mit einer anästhesierten transgenen Maus mit einem kreisförmigen Glasfenster und einer Kopfplatte, die auf ihrem Schädel implantiert ist.

Die Mikroglia- oder Immunzellen und Neuronen werden mit fluoreszierenden Proteinen markiert.

Als nächstes befestigen Sie die Maus auf dem Zwei-Photonen-Mikroskoptisch.

Injizieren Sie dann intraperitoneal einen Fluoreszenzfarbstoff, um die Blutgefäße rot zu färben.

Reinigen Sie das Glasabbildungsfenster, tragen Sie einen Kochsalztropfen auf und senken Sie das Mikroskopobjektiv ab.

Als nächstes stellen Sie das Laserlicht so ein, dass es ein Bild der Blutgefäße aufnimmt. Notieren Sie das Verzweigungsmuster und die Koordinaten, um denselben Bereich später zu lokalisieren und abzubilden.

Stellen Sie nun den Laser so ein, dass er die fluoreszierenden Proteine anregt, wodurch die Mikroglia und Neuronen fluoreszieren.

Lokalisieren Sie anhand des aufgezeichneten Verzweigungsmusters dieselbe Region und nehmen Sie regelmäßig Bilder von Zellen auf.

Das vaskuläre Netzwerk und die Neuronen bleiben stabil, während die Positionsänderungen der Mikroglia im Laufe der Zeit die Immundynamik als Reaktion auf neuronale Aktivität widerspiegeln.

Bohren Sie mit einem Zahnbohrer eine kreisrunde Öffnung ca. 4 Millimeter in den Schädel. Befeuchten Sie den Schädel während des Bohrens regelmäßig mit steriler Kochsalzlösung und Wattestäbchen, um das Gehirn zu kühlen. Entfernen Sie Knochenreste und machen Sie den Schädelknochen weich.

Wenn du fertig bist, entferne diesen Teil des Schädels vorsichtig mit einer spitzen Pinzette. Nachdem der Schädel entfernt wurde, legen Sie vorsichtig ein kleines, mit Kochsalzlösung angefeuchtetes Deckglas in die Kraniotomie. Trocknen Sie überschüssige Kochsalzlösung mit einem sterilen Tuch ab. Tragen Sie mit einem spitzen Applikator Cyanacrylatkleber um das Fenster herum auf und lassen Sie ihn am Gehirn und am Schädel haften.

Tragen Sie den Grundkleber auf den Rest des Schädels auf und härten Sie ihn mit einem Polymerisationslicht 20 bis 40 Sekunden lang aus. Schaffen Sie mit dem letzten Kleber eine Vertiefung um das Fenster und härten Sie sie mit einem Polymerisationslicht 20 bis 40 Sekunden lang aus. Kleben Sie eine kleine Kopfplatte mit dem Primerkleber auf den Schädel auf der kontralateralen Hemisphäre der Kraniotomie und härten Sie dann mit dem letzten Kleber beide 20 bis 40 Sekunden lang aus.

Nachdem die Maus aufgewacht ist, injizieren Sie eine subkutane Dosis Buprenorphin SR als postoperative Analgesie, die für 72 Stunden ausreicht. Versorgen Sie die Maus mit extra weichem Futter, um eine gesunde Regeneration zu erleichtern. Die Bildgebung kann bereits zwei Wochen nach der Implantation durchgeführt werden. Montieren Sie die Kopfplatte mit Schrauben auf dem Zwei-Photonen-Mikroskoptisch, der mit einer Heizplatte auf 35 Grad Celsius gehalten werden sollte.

Injizieren Sie der Maus subkutan 100 Mikroliter Blutgefäßfarbstoff, wie z. B. Rhodamin B. Reinigen Sie die Oberfläche des Schädelfensters vorsichtig mit einem Wattestäbchen, das mit 70 % Ethanol getupft ist. Geben Sie ein paar Tropfen Wasser oder Kochsalzlösung auf das Fenster und senken Sie die Objektivlinse in die Lösung. Stellen Sie sicher, dass der Laser ausgeschaltet ist, während das Objektiv abgesenkt wird.

Zeichnen Sie von Hand eine Kurskarte, um die wichtigsten Orientierungspunkte der Blutgefäße zu markieren, während Sie durch das Okular schauen. Verwenden Sie diese Zeichnung, um die spezifischen Bereiche während der Zwei-Photonen-Bildgebung zu identifizieren. Sammeln Sie Bilder von fluoreszierenden Zellen und Gefäßen mit Hilfe der Zwei-Photonen-Bildgebung. Zu den bildgebenden Parametern siehe Textmanuskript. Machen Sie sich sorgfältig Notizen mit geeigneten Koordinaten, um sicherzustellen, dass die genauen Bereiche für die spätere Bildgebung erneut besucht werden können.

Erfassen Sie in dieser ersten Bildgebungssitzung mehrere Sichtfelder.