Fluoreszenzbildgebung der Kalziumdynamik an neuromuskulären Verbindungen im Zwerchfell einer transgenen Maus

Beginnen Sie mit einem Fluoreszenzmikroskop, das ein immobilisiertes Zwerchfell mit Zwerchfellnerven einer transgenen Maus enthält.

Die neuromuskuläre Verbindung des Zwerchfells besteht aus einem Motoneuron, einer Muskelfaser und Schwann-Zellen, die Acetylcholinrezeptoren und Kalziumkanäle enthalten.

Diese Zellen haben fluoreszenzmarkierte Acetylcholinrezeptoren und exprimieren intrazelluläre Kalziumindikatoren.

Ein an den Aufbau angeschlossener Bildsplitter ermöglicht die gleichzeitige Visualisierung beider Fluoreszenzsignale.

Der Nervus phrenicus wird in einer Saugelektrode positioniert, um einen elektrischen Reiz abzugeben.

Visualisieren Sie unter dem Fluoreszenzmikroskop Acetylcholinrezeptoren, um eine neuromuskuläre Verbindung zu identifizieren.

Um eine maximale Ausgangsfluoreszenz einzustellen, fügen Sie eine Kaliumchloridlösung hinzu, um die Zellmembran vorübergehend zu depolarisieren. Dies löst einen intrazellulären Kalziumeinstrom aus, was zu einer Erhöhung der Fluoreszenz der Indikatoren führt.

Passen Sie die Helligkeitseinstellungen an, um eine Übersättigung des Fluoreszenzsignals zu vermeiden.

Wenden Sie nach der Repolarisation elektrische Stimulationen an, um den Kalziumeinstrom in die Zelle auszulösen, und zeichnen Sie die Änderung der intrazellulären Fluoreszenz mit einer hohen Bildrate auf.

Lokalisieren Sie bei 20-facher Vergrößerung das Endplattenband in der Mitte des Muskels, indem Sie unter Anregung von grün-gelbem Licht nach fluoreszenzmarkierten alpha-Bungarotoxin-neuromuskulären Verbindungen suchen. Schalten Sie auf Blaulichtanregung um, um Kalziumreaktionen in Muskel-, Motoneuronen- oder Schwann-Zellen abzubilden. In diesem Beispiel wird GCaMP 3 in Muskelzellen exprimiert.

Falls gewünscht, richten Sie den Bildsplitter mit Bandpassfiltern und dichroitischem Einkantenfilter für die Bildgebung mit zwei Wellenlängen ein. Führen Sie Experimente mit der Helligkeitsleiste in der Nachschlagetabelle durch, die auf 110 % des Niveaus eingestellt ist, bei dem der genetisch kodierte Kalziumindikator, der Gewebe exprimiert, eine Sättigung bei 20-facher Vergrößerung aufweist, ohne dass als Reaktion auf Kaliumchlorid Binning erforderlich ist.

Nehmen Sie mit 20 Bildern pro Sekunde auf, um keine schnellen Ereignisse zu verpassen. Stimulieren Sie mit 1 bis 45 Sekunden Nervenstimulation von 20 bis 40 Hertz, indem Sie mit einer Saugelektrode eine Reihe von Impulsen abgeben. Und sammeln Sie dynamische fluoreszierende Kalziumreaktionen in einem Zellsubtyp zusammen mit dem statisch fluoreszenzmarkierten alpha-Bungarotoxin-Signal für die neuromuskuläre Verbindung.