Quantifizierung neu erzeugter Neuronen im Hirngewebe von Ratten mit der optischen Fraktionatortechnik

Nehmen Sie Hippocampus-Hirnschnitte von einer Ratte, die mit Bromodeoxyuridin oder BrdU, einem Nukleosidanalogon von Thymidin, injiziert wurde.

BrdU integriert sich während der Zellteilung in die DNA und markiert neu gebildete Neuronen im Gyrus dentatus, einer Region für die Neurogenese.

Inkubieren Sie mit einem Oxidationsmittel, um endogene Peroxidase-Enzyme zu inaktivieren.

Mit Säure behandeln, um die DNA zu denaturieren und BrdU freizulegen, dann die Säure neutralisieren.

Inkubieren Sie mit einem Detergens zur Permeabilisierung der Zellmembranen und einer Blockierungslösung, um unspezifische Bindungsstellen zu maskieren.

Inkubieren Sie mit primären Antikörpern, die auf BrdU abzielen, gefolgt von Peroxidase-markierten Sekundärantikörpern, die spezifisch für die primären Antikörper sind.

Führen Sie ein chromogenes Substrat und ein Oxidationsmittel ein, so dass die Peroxidase das Substrat in einen farbigen Rückstand umwandeln kann.

Befestigen Sie das Gewebe und färben Sie es mit einem Nukleinsäure-bindenden Farbstoff gegen.

Dehydrieren Sie das Gewebe und behandeln Sie es dann, um die Transparenz zu erhöhen.

Identifizieren Sie unter dem Mikroskop den Gyrus dentatus.

Analysieren Sie mit der optischen Fraktionatortechnik mehrere Ebenen über die Gewebedicke, um BrdU-markierte Neuronen zu quantifizieren.

Wenn Sie mit der Immunfärbung beginnen können, lassen Sie die Abschnitte auf Raumtemperatur kommen. Verwenden Sie dann einen Pinsel, um jeden fünften Abschnitt aus einer Reihe von Hippocampus-Abschnitten auf 25-Well-Färbenetze zu übertragen, die in mit PBS gefüllten Petrischalen platziert werden. Es sollten 8 bis 12 Schnitte pro Hippocampus für die Färbung vorhanden sein. Übertragen Sie die Färbenetze, die die Abschnitte enthalten, in passende Glasschalen, die PBS enthalten, und waschen Sie die Abschnitte zweimal 10 Minuten lang in PBS.

Dann 20 Minuten lang in 3% Wasserstoffperoxid inkubieren. Nach dem Waschen die Abschnitte durch drei Salzsäurelösungen bewegen. Neutralisieren Sie dann in 0,1 molaren Natriumtetraborat bei Raumtemperatur für 20 Minuten.

Nach dreier 10-minütiger Inkubation im Wechsel des Waschpuffers werden die Abschnitte für eine Stunde bei Raumtemperatur in eine Blocklösung überführt. Inkubieren Sie dann die Abschnitte in Maus-Anti-BrdU, verdünnt 1 bis 100 in Blockierungslösung für 48 Stunden bei 4 Grad Celsius.

Nach der Inkubation des primären Antikörpers waschen Sie dreimal für jeweils 10 Minuten in Waschpuffer und inkubieren Sie dann 48 Stunden lang in Meerrettichperoxidase, verdünnt 1 bis 10 in Waschpuffer. 48 Stunden später übertragen Sie die Schnitte für 10 Minuten auf PBS und wiederholen Sie den Vorgang für insgesamt fünf Wäschen. Übertragen Sie die Abschnitte nach dem Waschen für sieben Minuten in DAB-Lösung. Dann 10 Minuten lang in eine DAB-Lösung mit 0,02 % Wasserstoffperoxid überführen.

Montieren Sie die Schnitte nach einer Reihe von Waschgängen in numerischer Reihenfolge auf Objektträgern. Ca. 30 Minuten trocknen lassen. Trocknen Sie dann die Proben an der Luft, indem Sie sie in ein Objektträgergestell legen. Rehydrieren Sie die Proben anschließend 10 Minuten lang in einer Objektträgerfärbeschale mit destilliertem Wasser.

Übertragen Sie dann die Objektträger für 15 Minuten in destilliertes Wasser auf 0,02 % Kristallviolett. Nachdem Sie die kristallviolette Färbung wiederholt haben, rehydrieren Sie die Abschnitte durch eine Ethanolserie. Reinigen Sie dann die Abschnitte zweimal für jeweils 15 Minuten mit Xylol. Fügen Sie zum Schluss schnell trocknendes Einbettmedium hinzu und decken Sie die Objektträger ab.

Nach 24 Stunden können die Objektträger für die Mikroskopie verwendet werden. Beginnen Sie mit der Überprüfung der Dicke des Gewebes, indem Sie zuerst die Objektträger auf den motorisierten Tisch des Mikroskops legen und dann die Stereologiesoftware öffnen. Markieren Sie den interessierenden Bereich mit einem Objektiv mit geringer Vergrößerung, bevor Sie zu einem 100-fachen Ölimmersionsobjektiv wechseln.

Wählen Sie dann einen bestimmten Punkt im Abrechnungsrahmen aus, z. B. einen Bereich, der an eine Ecke angrenzt, und positionieren Sie den oberen Rand des Schnitts, indem Sie ihn entlang der Fokusebene verschieben, bis ein Element des Schnitts scharf angezeigt wird. Registrieren Sie diese Z-Position als 0. Bewegen Sie dann die Fokusebene durch das Gewebe nach unten, bis die letzte z-Ebene des Gewebes scharf ist, und markieren Sie dann diese Position. Die lokale Gewebedicke wird von 0 bis zu diesem Endpunkt definiert und kann auf der z-Achse abgelesen werden.

Registrieren Sie die Gewebedicke. Die Gewebedicke wird an mehreren Stellen innerhalb der interessierenden Region gemessen. Die Höhe des Dissektors und der Schutzzonen, die Größe der Zählung, der Rahmen, die Schrittlänge und die endgültige Vergrößerung werden in einer Pilotstudie bestimmt. Jetzt können Sie mit der Zählung der BrdU-positiven Neuronen beginnen, normalerweise bei einer endgültigen Vergrößerung von 2.000 bis 3.000x, mit einem 60-fachen Öl- oder 100-fachen Ölobjektiv und einer hohen numerischen Apertur.

Identifizieren Sie BrdU-positive Neuronen in jedem Zählrahmen, aber zählen Sie nicht diejenigen, die die rote Ausschlusslinie berühren. Zählen Sie die BrdU-positiven Neuronen, die die grüne Einschlusslinie berühren, und diejenigen, die innerhalb der Grenze des Zählrahmens liegen. BrdU-positive Neuronen werden nur gezählt, wenn das interessierende Merkmal innerhalb der Dissektorhöhe deutlich erkannt wird. Die hier gezeigten halbsichtbaren Neuronen werden nicht gezählt.