Live-Bildgebung des Drosophila-Puppenauges mittels Fluoreszenzmikroskopie

Beginnen Sie mit einer transgenen Drosophila-Puppe mit freiliegendem Auge.

Lege die Puppe auf eine Geleeperle in einem hydrierten Papierrahmen, der von einem Geleering umgeben ist.

Das Auge der Puppe enthält GFP-markierte Verbindungsproteine, die die Zellgrenzen im Neuroepithel des sich entwickelnden Auges hervorheben.

Drücken Sie vorsichtig ein Deckglas auf die Puppenauge.

Unter einem Fluoreszenzmikroskop fluoreszieren GFP-markierte Übergänge und zeigen die Organisation des Neuroepithels.

Nehmen Sie Bilder in regelmäßigen Abständen in verschiedenen Tiefen auf und bearbeiten Sie die Bilder, um den Kontrast zu verbessern und das Hintergrundrauschen zu minimieren.

Richten Sie diese Bilder in zunehmenden Zeitintervallen aus, um das sich entwickelnde Neuroepithel zu verfolgen.

Zunächst bilden Primärzellen Grenzen um Photorezeptorzellcluster, während Interommatidenzellen oder ICs sich zu einer einzigen Schicht anordnen.

Später differenzieren sich die ICs in Sekundär- und Tertiärzellen in der Nähe von Photorezeptoren.

Schließlich werden überschüssige ICs durch den programmierten Zelltod entfernt, wodurch ein hexagonales Gitter entsteht, das das organisierte Auge strukturiert.

Heben Sie das Operculum vorsichtig mit einer Pinzette an und entfernen Sie es, um den Puppenkopf freizulegen. Reißen Sie dann an der Seite der Puppenhülle entlang, um den Bereich um ein Auge freizulegen. Entferne die Puppe vorsichtig vom Klebeband.

Konstruieren Sie einen kleinen 15 Quadratmillimeter großen Rahmen aus Löschpapier und stanzen Sie ein 5 Millimeter großes Loch in die Mitte. Tauchen Sie den Rahmen in destilliertes Wasser und platzieren Sie ihn in der Mitte eines Objektträgers. Drücken Sie mit einer 30-ml-Spritze einen gleichmäßigen Ring aus Vaseline heraus, der den Rahmen des Löschpapiers umgibt.

Als nächstes gibst du eine kleine Kugel Vaseline direkt auf die Folie. Lege die Puppe vorsichtig auf die Seite und stütze sie mit der Vaselineperle. Lege ein Deckglas auf den Vaseline-Ring, so dass es das Epithel über dem Auge berührt. Komprimieren Sie das Präparat vorsichtig, um das Deckglas gegen die Vaseline zu versiegeln, und erzeugen Sie eine kleine, flache Kontaktfläche zwischen der Pupillen-Augen-Region und dem Deckglas.

Bilden Sie die Puppenpräparation mit einem Fluoreszenzmikroskop ab. Erfassen Sie alle sieben Minuten serielle Schnitte durch die apikale Domäne des Neuroepithels des Auges im Bereich des Adhärensübergangs. Verwenden Sie eine geeignete Dekonvolutionssoftware, um den Hintergrund zu reduzieren und den Kontrast der Serienschnittbilder zu verbessern.

Navigieren Sie für jede Z-Stapel-Datei in der LAS AF-Software zum Werkzeuge-Panel, wählen Sie 3D-Entfaltung aus, und klicken Sie auf Anwenden. Generieren Sie eine maximale Projektion oder ein MP-Bild für jede entfaltete Stapeldatei. Richten Sie jedes MP-Bild aus, um das Verhalten einzelner Zellen hervorzuheben und Ablenkungen durch das Wachstum von Organismen zu reduzieren, indem Sie die integrierten Algorithmen in Photoshop CS5 verwenden.

Öffnen Sie auf der Registerkarte Datei des Hauptmenüs Skripts und wählen Sie Dateien in Stack laden aus. Importieren Sie als Nächstes die MP-Bilddateien in das Bedienfeld "Layer laden". Stellen Sie sicher, dass die Option "Versuch, Quellbilder automatisch auszurichten" nicht aktiviert ist, da sonst die Bilddaten verzerrt werden können. Nachdem alle MP-Dateien in den Ebenenbereich geladen wurden, überprüfen Sie, ob alle Bilder in chronologischer Reihenfolge vorliegen und dass sich der früheste Zeitpunkt oben im Ebenenstapel befindet. Ziehen Sie sie bei Bedarf per Drag & Drop, bis sie korrekt angeordnet sind.

Wählen Sie dann "Ebenen automatisch ausrichten" aus. Wählen Sie Neu positionieren und klicken Sie auf OK.