Überwachung der Gewinnung von laserablierten Interneuromastzellen im Zebrafisch mittels konfokaler Mikroskopie

Beginnen Sie mit einer Zebrafischlarve, die fluoreszenzmarkierte Interneuromastzellen oder INMCs enthält, die auf ein Deckglas montiert und unter ein konfokales Mikroskop gelegt werden.

INMCs sind Vorläuferzellen mit regenerativen Fähigkeiten, die zuvor einer Laserablation unterzogen wurden.

Beobachten Sie zunächst den beschädigten Bereich im Fluoreszenzmodus. Das Fehlen von Fluoreszenz bestätigt die erfolgreiche Laserablation.

Verwenden Sie anschließend den Durchlicht-Bildgebungsmodus, um den beschädigten Bereich zu untersuchen, in dem die Zelle körnig und geschwollen mit unregelmäßigen Zellkernen erscheint, was den Zelltod bestätigt.

Die Rekrutierung von Makrophagen an die Stelle deutet auf eine aktive zelluläre Reaktion auf Verletzungen hin.

Wechseln Sie nun zurück in den Fluoreszenzmodus und nehmen Sie in regelmäßigen Abständen Zeitrafferbilder auf, um die Genesung zu überwachen.

Während der Erholungsphase verlängern INMCs die Projektionen in die Lücke, um den Verschluss zu erleichtern und die zelluläre Reparatur zu fördern.

Speichern Sie diese Zeitreihenbilder für die Analyse. Das Wiederauftreten einer ausgeprägten Fluoreszenz im ablierten Bereich bestätigt die erfolgreiche Zellrückgewinnung.

Um die Zellkörper nach der Ablation abzubilden, deaktivieren Sie im Menü Kanäle die DAPI-Spur, um den Ablationslaser zu deaktivieren, und öffnen Sie das Menü für den Aufnahmemodus. Klicken Sie auf Zoom und verringern Sie den Zoom auf 0,7.

Um den Erfolg der Zellablation zu beurteilen, scannen Sie das Sichtfeld schnell. Erfassen und speichern Sie mit den gleichen Einstellungen wie für das Präablations-Imaging ein Bild nach der Ablation. Untersuchen Sie das Kanalbild der Durchlicht-Photomultiplier-Röhre, um die zelluläre Schädigung weiter zu bestätigen. Beschädigte Zellen zeigen ein körniges Aussehen, und die Zellkerne schwellen häufig an oder erscheinen unregelmäßig in der Form.

Um die Wiederherstellung des Zellkörpers nach der Ablation zu beurteilen, aktivieren Sie sowohl die Tischposition als auch die Zeitoptionen für die Zeitrafferaufnahme und stellen Sie die Zeitparameter auf den entsprechenden experimentellen Zeitpunkt und die 15-Minuten-Intervalle ein. Starten Sie dann das Experiment, um Bilder zu erfassen, und speichern Sie die resultierende Datei, wenn Sie fertig sind.