Visualisierung der Astrozytenmorphologie mit Hilfe des Fluoreszenzfarbstoffs Iontophorese in einem fixierten Maushirnschnitt

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurowissenschaften

0 Ansichten • 4:19 Min. • May 29th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Legen Sie eine chemisch fixierte Maushirnscheibe in eine Glasbodenschale mit Puffer und befestigen Sie sie mit einem Netz.

Schließen Sie eine Elektrode, die mit einem anionischen, hydrophilen Fluoreszenzfarbstoff gefüllt ist, an eine Spannungsquelle an.

Führen Sie eine Masseelektrode in den Puffer ein, um den Stromkreis zu schließen.

Schieben Sie die mit Farbstoff gefüllte Elektrode mit Hilfe einer Hellfeldbeleuchtung in Richtung der Scheibe.

Wechseln Sie zur Infrarot-Differenzialinterferenzkontrastbildgebung, um einen Astrozyten zu lokalisieren.

Durchstechen Sie das Astrozyten-Soma mit der Elektrode, um Zugang zum Zytoplasma zu erhalten.

Wenden Sie elektrischen Strom an, um den Farbstoff durch Iontophorese in das Zytoplasma zu treiben.

Wechseln Sie zur konfokalen Mikroskopie, um die Farbstoffbewegung zu überwachen.

Der hydrophile Farbstoff, der die hydrophobe Membran nicht passieren kann, diffundiert im Zytoplasma, um das Soma und die Äste zu füllen.

Sobald die Zelle gefüllt ist, stoppen Sie den Strom und ziehen Sie die Elektrode heraus.

Lassen Sie die Astrozytenmembran wieder verschließen.

Nehmen Sie Bilder in verschiedenen Z-Ebenen auf und rekonstruieren Sie sie, um die Morphologie der Astrozyten zu visualisieren.

Für den Farbstoffinjektionstest legen Sie eine leicht fixierte Gehirnscheibe vorsichtig in eine Glasbodenschale, die bei Raumtemperatur mit 0,1 molaren PBS gefüllt ist. Und halten Sie die Scheibe mit einer Platinharfe mit Nylonsaiten an Ort und Stelle.

Schließen Sie die Elektrode an eine Spannungsquelle an und legen Sie die Masseelektrode in das Bad, in dem sich die Hirnscheibe befindet. Bewegen Sie das Objektiv eines konfokalen Mikroskops auf die gewünschte Gehirnregion.

Senken Sie die Elektrode mit der 10-fachen Wasserimmersionslinse in die Lösung ab und bewegen Sie die Elektrode in die Mitte des Sichtfelds. Senken Sie dann bei hellem Feld die Elektrode langsam in Richtung der Scheibe ab und stoppen Sie knapp über der Oberfläche.

Um einen interessierenden Astrozyten mit Iontophorese zu füllen, verwenden Sie den infraroten differentiellen Interferenzkontrast, um Astrozyten mit länglichen, ovalen Somaten mit einem Durchmesser von etwa 10 Mikrometern und 40 bis 50 Mikrometern unter der Schnittoberfläche zu identifizieren.

Dabei handelt es sich um das Stratum radiatum des Hippocampus direkt unterhalb der pyramidalen Zellschicht. Während wir uns durch das Gewebe bewegen, können wir Blutgefäße, Neuronen, Astrozyten und andere Zelltypen sehen.

Sobald ein Astrozyt ausgewählt wurde, bewegen Sie die Zelle in die Mitte des Sichtfeldes und senken Sie die Elektrodenspitze langsam in die Scheibe. Navigieren durch das Gewebe, bis sich die Elektrode auf der gleichen Ebene wie der Zellkörper befindet.

Sobald der Zellkörper des Astrozyten deutlich sichtbar und umrissen ist, schieben Sie die Elektrode langsam und sanft nach vorne und bewegen Sie die Elektrode, bis die Spitze das Soma der Zelle aufspießt.

Bewegen Sie den Fokus des Objektivs langsam auf und ab, um festzustellen, ob sich die Elektrode im Soma befindet. Sobald sich die Elektrodenspitze in der Zelle befindet, schalten Sie den Stimulator bei 0,5 bis 1 Volt ein, um kontinuierlich Strom in die Zelle zu leiten.

Beobachten Sie mit dem konfokalen Mikroskop, wie sich die Zelle füllt, indem Sie den Digitalzoom erhöhen, um die Details der Zelle zu visualisieren und sicherzustellen, dass die Spitze der Elektrode bei Bedarf in der Zelle sichtbar ist.

Warten Sie etwa 15 Minuten, bis die feineren Verzweigungen und Prozesse definiert erscheinen, bevor Sie die Spannung ausschalten und die Elektrodenspitze vorsichtig aus der Zelle ziehen.

Um die gefüllte Zelle abzubilden, warten Sie 15 bis 20 Minuten, bis die Zelle wieder in ihre ursprüngliche Form zurückkehrt, bevor Sie die Einstellung am Konfokalmikroskop anpassen, um sicherzustellen, dass die feineren Äste und Prozesse unter dem 40x-Objektiv definiert erscheinen.

Richten Sie einen Z-Stack mit einer Schrittweite von 0,3 Mikrometern ein und bewegen Sie das Objektiv während der Bildgebung, bis kein Signal mehr von der Zelle zu hören ist. Und setzen Sie diesen Schritt als Spitze.

Bewegen Sie dann das Objektiv nach unten und fokussieren Sie durch die Zelle, bis kein Signal mehr zu hören ist. Und legen Sie diesen Schritt als unteren Punkt fest.

11:19

Die extrazelluläre Aufnahme neuronaler Aktivität in Kombination mit Microiontophoretic Anwendung von neuroaktiven Substanzen in Awake Mäuse

Ähnliche Videos

0 Aufrufe

10:45

Echtzeit-Iontophorese mit Tetramethylammonium zur Quantifizierung der Volumenfraktion und Tortuosität des Gehirns extrazellulären Raumes

Ähnliche Videos

0 Aufrufe

10:53

Analyse des Astrozytengebietsvolumens und der Kachelung in dicken frei schwebenden Gewebeabschnitten

Ähnliche Videos

0 Aufrufe

10:41

Ein organotypischen Assay für High-Resolution Time-Lapse Imaging neuronaler Migration in der postnatalen Gehirn

Ähnliche Videos

0 Aufrufe

04:46

Immunfärbung von fluoreszenzmarkierten Astrozyten in einem Schnitt aus einem Gewebeschnitt aus dem Gehirn einer Maus

Ähnliche Videos

0 Aufrufe

12:47

Induktion von Plastizität Astrozytäre Rezeptoren durch Manipulation der neuronalen Feuerraten

Ähnliche Videos

0 Aufrufe

10:10

Analyse der Größe, Form und Direktionalität von Netzwerken von gekoppelten Astrozyten

Ähnliche Videos

0 Aufrufe

07:38

Visualisierung der Astrozytenmorphologie mit Luzifer gelben Iontophorese

Ähnliche Videos

0 Aufrufe

07:19

Visualisierung und Analyse des intrazellulären Transports von Organellen und anderen Ladungen in Astrozyten

Ähnliche Videos

0 Aufrufe

11:20

Bildgebung von intrazellulärem ATP in organotypischen Gewebescheiben des Maushirns mit dem FRET-basierten Sensor ATeam1.03YEMK

Ähnliche Videos

0 Aufrufe

Zuletzt aktualisiert: 15 August 2026