Visualisierung des Kalziumeinstroms in ventralen Mittelhirnneuronen aus Mausembryonen

Nehmen Sie ein Deckglas mit einer Kultur von ventralen Mittelhirnneuronen, die von Mausembryonen stammen.

Die Zellen werden mit einem viralen Vektor infiziert, um einen Kalziumindikator zu exprimieren.

Übertragen Sie das Deckglas in die Aufnahmekammer eines konfokalen Mikroskops, das mit einem Aufnahmepuffer durchblutet ist.

Identifizieren Sie mit sichtbarem Licht eine Region mit mehreren Neuronen und wechseln Sie dann zur Fluoreszenzbildgebung.

Bei niedrigen intrazellulären Calciumspiegeln bleibt der Indikator ungebunden und weist eine geringe Fluoreszenzintensität auf.

Intrinsische Eigenschaften der Neuronen erzeugen spontane Aktionspotentiale, die spannungsgesteuerte Kalziumkanäle dazu bringen, sich zu öffnen und den Kalziumeinstrom zu ermöglichen.

Das überschüssige Kalzium bindet an den Indikator und induziert eine Konformationsänderung, die die Fluoreszenzintensität erhöht.

Zeichnen Sie die Fluoreszenzintensität im Laufe der Zeit auf, um die spontane Kalziumaktivität zu verfolgen.

Führen Sie einen Neurotransmitter in hoher Konzentration ein, der an Rezeptoren auf den Neuronen bindet und kontinuierliche Aktionspotentiale erzeugt.

Die anhaltende spannungsgesteuerte Aktivierung des Kalziumkanals verlängert den Kalziumeinstrom, was zu einer anhaltenden Erhöhung der Fluoreszenzintensität führt.

Bereiten Sie 1 Liter des HEPES-Aufzeichnungspuffers, 200 Milliliter 20 mikromolare Glutamat-Aufzeichnungspuffer und 200 Milliliter 10 mikromolare NBQX-Aufzeichnungspuffer gemäß den Anweisungen des Manuskripts vor. Füllen Sie eine sterile Millimeter-Petrischale mit 3 Millilitern des Aufnahmepuffers.

Nehmen Sie die Petrischale mit den infizierten Kulturen aus dem Inkubator, greifen Sie dann vorsichtig mit einer Pinzette mit feiner Spitze nach dem Rand eines Deckglases und geben Sie es in die Schale mit dem Aufnahmepuffer. Legen Sie das restliche Deckglas in Medium zurück in den 37 Grad Celsius heißen Inkubator und transportieren Sie die Schale mit dem Aufnahmepuffer zum Konfokalmikroskop.

Starten Sie die Imaging-Software. Starten Sie während der Initialisierung die Peristaltikpumpe und legen Sie die Leitung in den Aufnahmepuffer. Kalibrieren Sie dann den Durchfluss auf 2 Milliliter pro Minute. Übertragen Sie das infizierte Deckglas mit einer feinen Pinzette aus der Petrischale in das Aufnahmebad. Finden Sie mit dem 10-fachen Wasserimmersionsobjektiv und dem Hellfeldlicht die Fokusebene und suchen Sie nach einer Region mit einer hohen Dichte an Neuronenzellkörpern. Wechseln Sie dann zum 40X-Objektiv und fokussieren Sie die Probe neu.

Wählen Sie Alexa Flour 488 im Farblistenfenster aus und wenden Sie es an. Um eine Überbelichtung und Photobleichung der Fluorophore zu vermeiden, beginnen Sie mit niedrigen HV- und Laserleistungseinstellungen. Stellen Sie für den Alexa Fluor 488-Kanal den HV auf 500, die Verstärkung auf 1x und den Offset auf Null ein. Stellen Sie die Leistung für die 488-Laserlinie auf 5 % ein, erhöhen Sie die Lochblende auf 300 Mikrometer und verwenden Sie die Focus x2-Scanoption, um die Emissionssignale optimal an die Untersättigung anzupassen.

Die Einstellungen können dann für eine optimale Sichtbarkeit jedes Kanals angepasst werden. Sobald die Mikroskopeinstellungen optimiert sind, bewegen Sie den Tisch, um eine Region mit mehreren Zellen zu lokalisieren, die spontane Änderungen der GCaMP6f-Fluoreszenz aufweisen, und fokussieren Sie auf die gewünschte Ebene für die Bildgebung. Verwenden Sie das Werkzeug Rechteck schneiden, um den Bildrahmen auf eine Größe zu beschneiden, die ein Bildintervall von knapp einer Sekunde erreicht. Legen Sie das Intervallfenster auf den Wert 1,0 und das Num-Fenster auf 600 fest.

Um einen Film der T-Serie aufzunehmen, wählen Sie die Option "Zeit" und verwenden Sie dann die Option "XYt-Scan", um mit der Aufnahme zu beginnen. Beobachten Sie den Fortschrittsbalken der Bildgebung und verschieben Sie die Leitung vom HEPES-Aufzeichnungspuffer zum richtigen Zeitpunkt in den 20-Mikromol-Glutamat-Aufzeichnungspuffer. Wenn die Bildbearbeitung abgeschlossen ist, wählen Sie die Schaltfläche Serie fertig aus, und speichern Sie den fertigen Film der T-Serie. Fahren Sie fort, das Glutamat für weitere fünf Minuten zu perfundieren, so dass die kultivierten Neuronen insgesamt 10 Minuten lang Glutamat ausgesetzt waren.

Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes Deckglas, das abgebildet werden soll. Es ist möglich, Kalziumspuren in neuronalen Zellkörpern unmittelbar nach dem Experiment zu sehen. Verwenden Sie das Ellipsenwerkzeug, um die gewünschte Anzahl von ROIs um das neuronale Soma zu zeichnen, und verwenden Sie die Schaltfläche für die Reihenanalyse, um die Ablaufverfolgungen zu visualisieren. Entfernen Sie nach der zusätzlichen fünfminütigen Exposition mit Glutamat das Deckglas mit einer feinen Pinzette aus dem Bad und legen Sie es mit dem Aufnahmepuffer wieder in die Petrischale, bis alle Bildgebungen abgeschlossen sind.